Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của một chủng nấm Vân chi đen có nguồn gốc từ Trung Quốc

MỤC LỤC

Quy trình nuôi trồng thu sinh khối

Trong cuốn “Dược vật học” đời nhà Minh (Trung Quốc) ghi lại rằng: “Nấm vân chi đen và lục bồi bổ khí huyết, tăng năng lượng cuộc sống, và nó còn có tác dụng làm vững gân cốt. Vân chi được dùng dưới dạng trà có tác dụng hạ thấp lượng cholesterrol máu, áp suất máu, chống chứng rối loại nhịp tim, điều khiển nồng độ đường trong máu. Các báo cáo từ những năm 1960 đã cho thấy lợi ích về sức khỏe trong điều trị ung thư dạ dày khi uống trà “Saruno-koshikake” có chứa nấm vân chi Trametes versicolor.

Ở Trung Quốc, vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá. Ngoài ra trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc, vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt. Trong điều trị ung thư, khi sử dụng kết hợp PSP, PSK (hợp chất trích từ nấm) với hoá trị hay xạ trị sẽ làm tăng tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư và làm giảm các triệu chứng do hoá trị hay xạ trị gây ra.

Chỉ tìm thấy một biểu hiện nhỏ khi sử dụng PSK là nó làm đen các đầu ngón tay ở một số rất ít bệnh nhân chịu tác dụng điều trị (khoảng 4/77 người mắc phải). Một số biệt dược của nấm vân chi: Vân chi, Lục bảo Vân chi, (PSK) VPS – Coriolus versicolor, Coriolus-VPS® , PSK® , Yunzhi Polysaccharide peptide (Trade mark Qing Kang), PSP polysaccharide-peptide (Landford).

Một số khái niệm sinh hoá

  • Khái niệm về polysaccharide [10],[15]
    • Amino acid [10],[20]

      Mỗi phõn tử lừi lại gắn liờn kết khụng cộng trị với nhiều phõn tử glycosaminoglycan ngắn hơn (condroitin sulfat, keratan sulfat, heparin sulfat) bằng các cầu glycosid nối các gốc đường với nhóm OH của serin hoặc threonin trong phân tử protein (liên kết O-. Các chất này đều được xem là những chất kích thích hệ miễn dịch và có hoạt tính kháng ung thư, thúc đẩy quá trình sản xuất tế bào miễn dịch, giảm nhẹ các triệu chứng do hoá trị, xạ trị, giảm đau, chống viêm nhiễm (Altern Med Rev 2-2000). Năm 1971, hơn 200 dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u được chọn lọc bởi các nhà nghiên cứu Nhật, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất vì nó bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách trung hoà các thuốc hoá trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư.

      PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhân hoá trị như 5-FU (5-fluorouracil), doxorubicin, cyclophosphamide (CPA), tegafur, cis-Blastin và mitomycin-C (MMC) để chữa trị ung thư, gia tăng khả năng sống còn của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai đoạn III và IV (Kaibara et al, 1970). Sự biểu hiện gen TNF-α (yếu tố gây hoại tử khối u) và interleukin-8 (IL-8) được cảm ứng mạnh ở những người tình nguyện khoẻ mạnh và những bệnh nhân ung thư dạ dày khi dùng PSK, mặc dù đáp ứng của mỗi người mỗi khác. PSK cũng ức chế sự phát triển trở lại sau hậu phẫu hoặc sự di căn các tế bào khối u ở các mẫu động vật thí nghiệm, cơ chế có lẽ là ngăn chặn sự di chuyển, sự xâm nhập, sự gắn kết với các tế bào màng trong và sự phát triển.

      Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tác động hỗ trợ hiệu quả giữa PSK và liệu pháp sinh học gồm vaccin L1210 gắn với concanavalin A (lectin gây phân bào) và kháng thể đơn dòng chống lại các tế bào ung thư ruột kết. Tăng sự biểu hiện của gen Interleukin-6 (IL-6) trong các tế bào lympho máu ngoại vi (PBL) ở người và do đó sản xuất ra IL-6 và cũng hoạt hoá tế bào bạch cầu để gia tăng quá trình sản xuất interferon α và γ lên gấp 2 – 4 lần.

      Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi beta-glucan trích từ nấm (Kidd, 2000)  2.4. Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi  [25], [28],  [33],  [34]
      Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi beta-glucan trích từ nấm (Kidd, 2000) 2.4. Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi [25], [28], [33], [34]

      Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) [5]

      • Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 1. Quá trình hoà tan
        • Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 1. Nguyên liệu
          • Các phương pháp chiết

            Bản chất của nguyên liệu: bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Khả năng hoà tan của dung môi: Khả năng hoà tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Sự thấm dung môi qua vách tế bào: Nguyên liệu còn tươi, còn nhiều nước làm chậm quá trình chiết đối với các dung môi kém phân cực.

            9 Siêu âm và vi sóng: Làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan và dung môi, tăng sự hoà tan và quá trình khuếch tán. Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10 000 vòng/phút) trong một thời gian ngắn (5 – 10 phút). Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng nguyên liệu trong những dụng cụ thích hợp.

            9 Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 9 Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa: Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần lần với một lượng nhỏ dung môi.

            Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. 9 Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Ưu điểm của phương pháp là quá trình chiết xảy ra nhanh; khuyến điểm là cần phải có dụng cụ, thiết bị thích hợp.

            Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua nguyên liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hoà tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối nguyên liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi /dịch chiết đi từ nơi nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. Quá trình ngấm kiệt được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi.

            VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

            Thời gian và địa điểm thực hiện 1. Thời gian

            • Hoá chất, môi trường sử dụng

              Nước chiết giá: 100g giá đậu + nước xay nhuyễn lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết giá. Nước chiết bắp: 100g bắp xay + nước nấu chín lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết bắp. Nước chiết khoai tây: khoai tây (200g) gọt vỏ, rủa sạch, cắt sợi, nấu và lọc lấy nước chiết + nước cất để tạo dung dịch nước khoai tây 1 lít.

              Môi trường bắp xay: Bắp xay nấu cho nở và bổ sung các thành phần dinh dưỡng. Môi trường mùn cưa: Mùn cưa cao su khô còn tốt trộn với vôi bột 1%, bổ sung nước, ủ qua đêm và tạo độ ẩm môi trường khoảng 60%. Nguyên tố Mùn cưa gỗ cao su Mùn cưa gỗ lim Mùn cưa gỗ tạp.

              Các dụng cụ, thiết bị cần sử dụng: đĩa petri, bình tam giác, chai thuỷ tinh, giấy lọc, máy đo pH, tủ ủ, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy.

              Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954)
              Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954)

              Phương pháp tiến hành thí nghiệm

              • Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 1 Hình thái cấu tạo quả thể
                • Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch

                  Ba ngày sau khi cấy, bắt đầu tiến hành đo đường kính hệ sợi lan theo thời gian. Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng). Thí nghiệm được tiến hành trên các môi trường có bổ sung thành phần dinh dường khác nhau để tìm môi trường nhân giống cấp hai tối ưu.

                  Tất cả các môi trường đều được bổ sung nước để tạo ẩm độ (khoảng 60%) cho hệ sợi nấm phát triển. Mỗi môi trường phân vào 10 ống nghiệm, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 121oC/2 giờ. Môi trường mùn cưa sau khi trộn vôi 1%, ủ qua đêm, được bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau và cho vào bịch polypropylen.

                  Ủ ở nhiệt độ phũng, theo dừi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trờn cỏc bịch mụi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar.

                  Thử nghiệm trên các môi trường được bổ sung các nguồn dinh dưỡng tự nhiên

                  Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor

                  Sinh khối thu được từ TN1 và TN2 sấy ở 45oC đến khối lượng không đổi xay nhuyễn cân P(g) ly trích lọc trên giấy đã cân bì sấy khô ở 45oC định lượng. So sánh tỉ lệ polysaccharide thô trích từ hệ sợi và quả thể nấm vân chi. 9 Sinh khối lấy từ môi trường BTH sấy khô xay nhuyễn cân P(g) ly trích l định lượng.

                  Sơ đồ 3.2: Quy trình  ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi [16],  [20]
                  Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi [16], [20]