Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do khuẩn Escherichia coli ở lợn

Đặc tính và ứng dụng

Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đề hấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loại kháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinh kháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó. Tuy nhiên, ta không thể có đủ lượng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhưng có một điều thú vị là kháng thể trong huyết thanh gà lại được truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà [36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh được các bệnh tật.

NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 1. Mẫu thí nghiệm

• Động vật thí nghiệm

Kháng huyết thanh chuẩn xác định nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh (serotype) của E.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp lấy mẫu

Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, ria một đường ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhưng không chạm vào đáy ống, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm tiêm miễn dịch cho 3 đàn gà thí nghiệm, mỗi đàn theo một qui trình khác nhau, sau đó định kỳ hàng tuần kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà để tìm ra qui trình hợp lý, cho hiệu giá kháng thể trong máu gà cao nhất, ổn định nhất.

Nuôi cấy đặc hiệu cho E. coli, sàng lọc vi khuẩn tạp

Kết hợp với các môi trường khác như là môi trường thạch máu, môi trường nước thịt, môi trường thạch thường, môi trường yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm giống với E. Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ 85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với E.

Tiến hành các phản ứng sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được

Theo các tài liệu nghiên cứu trước đây, các chủng có khả năng dung huyết là các chủng có độc tính, có khả năng gây bệnh trên lợn cao hơn so với các chủng không dung huyết (theo tài liệu nghiên cứu của: Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh và Đỗ Ngọc Thuý về kết quả phân lập E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị). Sau khi xác định khả năng dung huyết của các chủng, chúng tôi cấy 50 chủng này vào môi trường thạch bán lỏng trong ống nghiệm chữ U (cấy ở một đầu ống nghiệm) nuôi ở điều kiện 37oC, cứ sau 6 tiếng đọc kết quả 1 lần.

Định typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn phân lập được

Xác định độc lực của từng chủng E. coli đã phân lập

Ngoài ra, kết hợp với Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, sử dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi còn xác định được sự có mặt của các gen độc tố của E. Chúng tôi đã chọn lọc ra được 13 chủng có độc lực, tiếp theo chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu tính kháng nguyên của các chủng này.

Xác định tính kháng nguyên của từng chủng E. coli đã phân lập

+ Trong số 13 chủng này chỉ có 3 chủng có tính kháng nguyên rất yếu, thể hiện qua hiệu giá kháng thể trong huyết thanh chuột không cao hơn nhiều so với huyết thanh của chuột đối chứng, đó là các chủng E15, E20, E24, do đó chúng tôi tạm thời loại bỏ chủng này. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này ngoài việc chế tạo kháng thể chống lại các kháng nguyên thân của vi khuẩn, còn phải chế tạo được các kháng thể đặc hiệu để trung hòa độc tố của vi khuẩn.

Nghiên cứu động thái sinh trưởng của E. coli

Để có thể chế tạo được kháng thể kháng độc tố, bước đầu tiên là chế tạo được kháng nguyên độc tố an toàn để miễn dịch cho động vật thí nghiệm. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố.

Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố E. coli

Sau khi nuôi cấy trên các môi trường có các công thức nuôi cấy khác nhau, dịch nuôi cấy sống được ly tâm ở 7000g/15 phút, thu phần nước trong, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 ỡm, dung dịch thu được sau khi lọc gọi là dịch chứa độc tố, ký hiệu là T2, chúng tôi tiến hành tiêm dịch qua lọc T2 cho chuột bạch 18 – 20 gam. Trước khi chuột chết có thể co dật hoặc không; cũng có trường hợp chuột chết nhanh, co dật mấy lần rồi chết, sau 48 giờ con nào không chết thì hồi phục dần.

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BẤT HOẠT VÀ GIẢI ĐỘC KHÁNG NGUYÊN 1. Nghiên cứu phương pháp làm bất hoạt và giải độc

• Xác định tính kháng nguyên của giải độc tố

+ Phương pháp giải độc bằng phenol và thiomersal không những không mang lại hiệu quả giải độc mà còn làm tăng tính độc của độc tố, do đó không thể dùng hai hóa chất này để giải độc được. Liều tiêm (ml). Hiệu giá ngưng kết. Dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc, độc lực giảm đi nhưng vẫn có tính kháng nguyên. Xác định tính kháng nguyên của giải độc tố. coli là một yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình gây bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn. Vì vậy, sau khi đã chế tạo được dịch nuôi chứa giải độc tố như trên, cần xác định tính kháng nguyên của giải độc tố trong dịch nuôi chứa độc tố đã giải độc. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của giải độc tố. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của giải độc tố trên đối tượng là chuột bạch với phương pháp như sau:. coli) được gọi là dịch nuôi chứa độc tố E.

NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT BỔ TRỢ LÀM TĂNG MIỄN DỊCH

Đối với chất bổ trợ là Al(OH)3 ở mỗi nồng độ khác nhau thì gây ra đáp ứng miễn dịch khác nhau trên động vật thí nghiệm. Từ những kết quả trên, chúng tôi quyết định chọn alum bổ sung với nồng độ 2 0/00 làm chất bổ trợ cho kháng nguyên và sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN CỦA KHÁNG NGUYÊN

Cụ thể là không có trường hợp nào động vật thí nghiệm bị chết hoặc hoặc phản ứng với chế phẩm.

NGHIÊN CỨU TÍNH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN VÀ NGHIÊN CỨU THỜI GIAN SẢN SINH MIỄN DỊCH SAU KHI TIÊM

Kết quả trên cho thấy, kháng huyết thanh của những động vật thí nghiệm được miễn dịch kháng nguyên có thêm chất bổ trợ alum 2 0/00 có hiệu giá cao hơn so với huyết thanh của những con đối chứng (được miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ). Điều này chứng tỏ kháng nguyên có bổ sung thêm chất bổ trợ alum 2 0/00 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tốt.

CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN THÍCH HỢP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ

Theo kết quả bảng 24: 15 lô kháng nguyên đã sản xuất đều đạt tiêu chuẩn và được đưa vào sử dụng, gây miễn dịch cho gà.

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH MIỄN DỊCH CHO GÀ

Sử dụng hai phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính và ADP để xác định hàm lượng kháng thể (phản ứng ngưng kết nhanh xác định hàm lượng kháng thể kháng với kháng nguyên thân E. Như vậy, với các lô kháng nguyên khác nhau, sau khi miễn dịch cho gà trong giai đoạn thu hoạch trứng làm nguyên liệu, hiệu giá kháng thể ngưng kết trong huyết thanh gà có hàm lượng luôn ổn định ở 1/128 đến 1/281,6; hiệu giá ADP dao động từ 1/8 đến 1/16.

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH KIỂM NGHIỆM VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM 1. Khảo sát chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm

Tớnh hiệu số của số lượng chuột sống sót của nhóm 1 (nhóm được tiêm miễn dịch bằng kháng thể lòng đỏ trứng) và số lượng chuột sống sót của nhóm 2 (nhóm đối chứng). Qua kết quả trên ta thấy, sản phẩm có khả năng bảo hộ tốt đối với chuột thí nghiệm (100%), trong khi nhóm đối chứng tỷ lệ chuột sống sót sau khi công cường độc chỉ đạt 20%.