Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc-xin cúm

VẬT LIỆU 1. Tế bào

• Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID 50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào)

Kháng huyết thanh khỉ VABIOTECH PBS SIGMA Zwittergent 10% VABIOTECH Agarose 1% VABIOTECH Dung dịch nhuộm màu VABIOTECH Dung dịch tẩy mầu VABIOTECH. * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp định lượng Protein tổng số. Dung dịch đồng sulfat (CuSO4) 2% VABIOTECH Dung dịch Tricloacetic acid (TCA) 5% VABIOTECH Dung dịch Tricloacetic acid (TCA) 10% VABIOTECH.

* Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp điện di trên gel SDS- PAGE. * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp kính hiển vi điện tử. Phiến nhựa nuôi cấy tế bào 96 giếng đáy bằng CORNING Phiến nhựa vi lượng 96 giếng đáy chữ U NUNC.

Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào). Công thức pha môi trường MEM STT Hóa chất Đơn vị Công thức pha 1 lít. Công thức pha môi trường DMEM STT Hóa chất Đơn vị Công thức pha 1 lít.

- Soi chai tế bào MDCK trên kính hiển vi, tế bào phải kín một lớp. - Cho Hanks vào chai tế bào, láng đều cho sạch hết tế bào chết rồi hút bỏ hết nước nổi. - Gõy nhiễm 100àl cỏc nồng độ pha loóng mẫu thử vào cỏc giếng khỏc nhau trên phiến, mỗi nồng độ pha loãng 4 giếng.

- Cho 100àl cỏc mụi trường duy trỡ cú bổ sung Trypsin đó xử lý TPCK vào mỗi giếng. Sử dụng 3 loại môi trường duy trì MEM, DMEM và LH3E ở từng phiến tế bào.

Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

Sau ngày thứ nhất, các phiến nuôi ở 32oC và 37oC tại cả 3 loại môi trường không có sự khác biệt nhiều, chưa xuất hiện hủy hoại ở nồng độ cao nhất là 10-1. Ngày thứ hai, phiến nuôi ở 37oC cả 3 loại môi trường đã xuất hiện hủy hoại trong khi phiến nuôi ở 32oC hầu như chưa quan sát được. Ngày thứ ba, phiến nuụi ở 37oC quan sỏt hủy hoại rất rừ cũn phiến nuụi ở 32oC có xuất hiện hủy hoại nhưng không nhiều bằng phiến nuôi ở 37oC.

Ngày thứ năm, không đọc được kết quả của phiến nuôi ở 37oC nhưng phiến nuôi ở 32oC vẫn quan sát được hủy hoại hình ảnh tương tự ngày thứ tư, giếng chứng tế bào không quá dày. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 3). Nhiệt độ Thời gian Môi. Nhiệt độ Thời gian Môi. Nhiệt độ Thời gian Môi. lần thử nghiệm). Kết quả ở 3 lần thử nghiệm cho thấy vi rút cúm được nuôi ở môi trường DMEM và MEM có kết quả tương tự nhau, còn ở môi trường LH3E tế bào hủy hoại kém hơn nhiều, do đó chúng tôi chọn nuôi ở môi trường MEM vì kết quả tốt và giá thành thấp hơn hơn môi trường nuôi cấy DMEM.

Trong nghiên cứu này, kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu vắcxin cúm, trường đại học Utah- Hoa Kỳ. Các tác giả tại đây cũng đã tìm ra các điều kiện để tiến hành chuẩn độ vi rút cúm là môi trường MEM và thời gian nuôi cấy vi rút là 4 ngày nhưng có điểm khác biệt là phương pháp được tiến hành ở nhiệt độ 37oC, có thể là do họ dùng dòng tế bào MDCK khác. Chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1.

Sau bước tinh chế bán thành phẩm cúm, chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp điện di mẫu trước siêu ly tâm và mẫu sau siêu ly tâm trên gel SDS-PAGE. Kết quả chạy SDS-PAGE cho thấy sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm. Đồng thời, với các phương pháp thông dụng hiện vẫn được áp dụng trong việc đánh giá chất lượng của kháng nguyên, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh các kháng nguyên vi rút cúm.

Phương pháp này được tiến hành trên các mẫu nuôi cấy vi rút cúm trên tế bào để quan sát quá trình nhân lên của vi rút cúm (Hình 3.9). Các vi rút cúm A/H1N1 được tổng hợp đã nẩy chồi ra khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hoàn toàn bị teo lại, quan sát thấy rất nhiều hạt vi rút hoàn chỉnh giải phóng ra bên ngoài tế bào. Mẫu bán thành phẩm vắcxin cúm sau khi tinh chế để thấy được tính toàn vẹn của hạt vi rút cúm với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút (Hình 3.10).

Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

Kistner và đồng nghiệp cũng đã thử nghiệm nuôi cấy chủng cúm H5N1 hoang dại trên tế bào Vero, hiệu giá HA sau khi nuôi cấy đạt 512-1024 và trên trứng gà có phôi cho hiệu giá HA là 1024-2048 Error: Reference source not found. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy vi rút cúm trên tế bào Vero đòi hỏi phải bổ sung Trypsin vào môi trường còn quy trình nuôi cấy vi rút cúm trên PMKC không cần thiết. Hiệu giá HA trong nước nổi thu được bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào thấp hơn trên trứng gà có phôi tuy nhiên thể tích nước nổi thu được từ nuôi cấy tế bào thì lại lớn hơn rất nhiều so với thể tích nước niệu đạo thu được từ trứng gà.

Qua đồ thị trên, các kết quả hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hiệu giá kháng nguyên HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cỳm phải đạt từ 128 HAU/50àl trở lờn. Thử nghiệm khuyếch tán miễn dịch dạng tròn đơn (SRID) là một thử nghiệm để định lượng kháng nguyên hòa tan bằng phản ứng kết tủa miễn dịch trên môi trường bán lỏng.

Theo quy định của TCYTTG, đối với vắcxin cúm mùa thông thường thử nghiệm công hiệu chính là thử nghiệm SRID với yêu cầu hàm lượng mỗi loại khỏng nguyờn HA phải đạt 15 àg/liều. Chính vì vậy để tạo nguồn huyết thanh chuẩn đặc hiệu cho thử nghiệm SRID, chúng tôi đã tiến hành gây miễn dịch trên khỉ Maccaca mulatta (nguồn khỉ sạch đã kiểm tra vi rút ngoại lai), trên thỏ và trên dê bằng kháng nguyên HA tinh khiết qua 4 mũi tiêm, mỗi mũi cách nhau 3 tuần. Kết quả cho thấy sử dụng huyết thanh khỉ cho hiệu giá HI cao nhất và khi sử dụng huyết thanh khỉ ở nồng độ 1,2 àg/ml agarose trong thử nghiệm SRID có kết quả định lượng HA cao nhất, hệ số tương quan của cả kháng nguyên chuẩn và mẫu thử đều đạt tiờu chuẩn (≥0,95), đảm bảo độ tuyến tớnh khi pha loóng, độ rừ nét vòng ngưng kết đạt yêu cầu.

Để xây dựng tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA trong quy trình sản xuất vắcxin cúm, chúng tôi đã dựa trên kết quả hàm lượng kháng nguyên HA của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1. Đối với vắcxin cúm sản xuất từ trứng gà có phôi, tiêu chuẩn của Protein tổng số không được vượt quá 6 lần hàm lượng HA Error: Reference source not found. Riêng về vắcxin cúm sản xuất trên tế bào, hiện nay chưa có tiêu chuẩn về Protein tổng số vì yêu cầu giới hạn về Protein và ADN tồn dư của tế bào chủ không nghiêm ngặt như trứng gà có phôi chứa nhiều Albumin.

Tuy nhiên hàm lượng Protein tổng số của các loạt vắcxin cúm sản xuất theo quy trình của chúng tôi đều không vượt quá 4 lần so với hàm lượng kháng nguyên HA. Qua đồ thị trên, các kết quả hàm lượng Protein tổng số đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng Protein tổng số ổn định. Từ các phân tích trên và dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số của vắc xin sản xuất trên trứng gà có phôi, chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng Protein tổng số trong quy trỡnh sản xuất vắcxin cỳm đạt từ 200 àg/ml đến 600 àg/ml.