Tính chất và chức năng công nghệ của Exopolysaccharide từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ whey sữa đậu nành

Quá trình sinh tổng hợp của exopolysacharide của vi khuẩn lactic EPS sản xuất từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn có rất nhiều đặc tính vượt

Còn đối với các loại đường như glucose, frutose thì vận chuyển qua màng tế bào bằng cơ chế vận chuyển chủ động, chúng được vận chuyển vào trong tế bào nhờ được cung cấp năng lượng ATP nên có thể đi qua màng tế bào theo chiều ngược gradient nồng độ. Sau khi tổng hợp xong, EPS sẽ được tiết ra môi trường ngoại bào.Ngược lại, với sự đa dạng của các cấu trúc phân tử được tìm thấy trong EPS, những con đường cho sinh tổng hợp và tiết ra môi trường bên ngoài của chúng trong hầu hết các vi khuẩn Gram âm đã được báo cáo theo một trong hai cơ chế:con đường Wzx–Wzy và con đường ABC.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysacharide

Và các polyme này được tiết ra ngoài thông qua hệ thống vận chuyển ABC, tiếp tục chuyển vị nó đến lớp nhầy giữa màng tế bào chất và màng ngoài tế bào, mang tính chất peptidoglycan và cuối cùng đến màng ngoài tế bào và ra ngoài môi trường. Ngoài các loại đường (glucose, galactose, lactose, mannose, fructose, vv) và các mối quan hệ giữa chúng, nồng độ của các loại đường có thể có tác dụng kích thích sự sinh tổng hợp EPS (Cerning et al. Các nguồn nitơ khác nhau như chiết xuất từ cao thịt, nấm men, tryptone, peptone, ammoniumsulfate, Ammonium oxalate và sodium nitrate cũng đã được thử nghiệm.

Seesuriyachan và cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng sinh EPS bởi Lab.confusus TISTR 1498 trong môi trường nước dừa có bổ sung các thành phần peptone, cao thịt, cao nấm với tỉ lệ nhất định. Trong một nghiên cứu khác của Lo và cộng sự (1997) cũng có kết quả tương tự, khi sản xuất xanthan từ Xanthomonas campestris, nếu nồng độ nitơ cao thì kết quả hàm lượng EPS tạo thành thấp. Khoáng chất và vitamin cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của LAB và khả năng sinh tổng hợp EPS.Vitamin có thể được bổ sung vào môi trường phát triển sản xuất để nângcao mức tăng trưởng và sản xuất EPS.

Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng sinh EPS của chủng Lactobacillus fermentum F6 qua nghiên cứu cho thấy hàm lượng EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lactobacillus fermentum F6 đã được công bố đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường sữa gầy, ở nhiệt độ 370 C và pH = 6,5. Những ảnh hưởng của nhiệt độ đối với việc sản xuất exopolysacharide trong Whey đã được nghiên cứu và sản lượng đã được tìm thấy ở 250C cao hơn so với ở 300 C hoặc 370 C. Lactobacillus sake tăng trưởng ở nhiệt độ thấp hơn, và tổng hợp EPS ở nhiệt độ cao hơn tuy nhiên tốc độ tăng trưởng trong giai đoạn này giảm theo cấp số nhân ở nhiệt độ thấp.

Tình hình nghiên cứu về EPS

Cấu trúc của EPS được sinh tổng hợp từ L.rhamnosus KL37B là một chuỗi lặp lại của các monosaccharide gồm glucose và galactose với tỉ lệ 3:6. Fukuda và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến tính chất lý hóa của EPS được sinh tổng hợp từ Lab. EPS sinh tổng hợp được trong trường hợp này có phân tử lượng đạt 1,2-1,9x106 Da và có thành phần các monomer bao gồm glucose và galactose theo tỉ lệ 2:1.

So với thế giới thì việc nghiên cứu, khai thác EPS sinh tổng hợp bởi vi khuẩn ở trong nước ít được quan tâm, nghiên cứu nhiều bởi việc nghiên cứu còn gặp một số khó khăn, thiếu thốn trong công tác chuẩn bị và tiến hành. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007), nghiên cứu Fucoidan – Polysaccharide chiết từ rong Nâu, sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, được ứng dụng trong y học và nuôi trồng thủy sản. Vì vậy Fucoidan có những ứng dụng quan trọng như: sản xuất thuốc phòng chống ung thư, thuốc có hiệu quả phòng trị bệnh đốm trắng cho tôm.

Năm 2013, Trần Thị Hồng Hà và cộng sự đã nghiên cứu, đánh giá hoạt tính sinh học của polysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nấm hương (Lentinus edodes). Kết quả nghiên cứu được các tác giả công bố rằng có 2 mẫu polysaccharide (Poly1, Poy2), mẫu Poly1 có hoạt tính gây độc với cả hai tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết (RD). Các chủng vi khuẩn được phân lập từ whey sữa đậu nành thu nhận ở địa bàn tp Huế, cung cấp bởi phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm, khoa Cơ khí- Công nghệ, trường Đại học Nông lâm Huế.

Hóa chất, dụng cụ, thiết bị .1 Hóa chất

Exopolysaccharide tách chiết từ các chủng vi khuẩn lactobaciluss plantarum W1,W12 phân lập từ whey sữa đậu nành.

Nội dung nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu .1 Phương pháp vi sinh

Các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn có được sau khi nuôi cấy trên đĩa petri trong khoảng từ 24 đến 48 giờ sẽ được tiếp tục bắt vào ống fancol có chứa 10ml môi trường MRS, sau đó được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Canh trường có chứa sinh khối vi khuẩn cùng một lượng EPS mà vi khuẩn sinh tổng hợp được đem xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao và được ngâm trong bể ổn định nhiệt ở nhiệt độ 950C trong 15 đến 20 phút. Hạ nhiệt độ của canh trường xuống nhiệt độ bình thường (25-30oC), cho một lượng TCA thích hợp với từng chủng vi khuẩn vào canh trường, bảo quản lạnh trong 24 giờ.

Chủng vi khuẩn gốc ở trạng thái lạnh đông được hoạt hóa trong eppendorf có chứa 1,5ml môi trường MRS lỏng, để trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ nhằm kích hoạt vi khuẩn hoạt động. Nuôi cấy trên môi trường MRS argar: Sử dụng que cấy đã được thanh trùng lấy vi khuẩn từ môi trường tăng sinh có chứa sinh khối của vi khuẩn cấy dàn lên đĩa petri có chứa môi trường MRS argar, sau đó nuôi trong tủ ẩm ở nhiệt độ 370C trong thời gian từ 24 đến 48 giờ cho tới khi thấy xuất hiện khuẩn lạc. Tăng sinh trong fancol: Sử dụng que cấy bắt khuẩn lạc đơn từ đĩa thạch sang nuôi cấy trong fancol 15ml có chứa sẵn 10ml môi trường MRS lỏng để tăng nhanh sinh khối vi khuẩn.

Mọi thao tác thực hiện đều phải được tiến hành trong tủ cấy ở điều kiện vô trùng vì vậy trước khi tiến hành các thủ tục nuôi cấy cần phải vệ sinh tủ cấy chuẩn bị các dụng cụ, môi trường cần thiết đặt vào trong tủ cấy và bật UV trong vòng 15 phút nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có hại. Sau đó dịch nuôi cấy được làm lạnh trong 24 giờ và tách các tế bào thu dịch nổi bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong thời gian 20 phút. Dịch nổi sau quá trình thẩm tích được đem sấy khô bằng máy đông khô (- 50oC; 0,001 mbar) để thu được EPS khô dùng để tiến hành khảo sát các tính chất liên quan.

Phương pháp toán học

EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic có nhiều ứng dụng thiết thực trong chế biến thực phẩm, trong y dược bởi nó có những tính chất, chức năng đặc biệt để cải thiện, nâng cao chất lượng của thực phẩm. Nuôi ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ cho vi khuẩn phát triển, tăng nhanh về số lượng tế bào, trước khi bắt khuẩn lạc vào fancol cần kiểm tra độ thuần chủng của vi khuẩn bắng cách quan sát hình thái các khuẩn lạc nếu chúng giống nhau thi thuần chủng. Plantarum trong fancol được chuyển sang nuôi cấy trong một lượng lớn môi trường MRS có bổ sung nguồn nitơ và carbon với hàm lượng thích hợp, tạo điều kiện tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp EPS.

Sau khi nuôi cấy xong thì tiến hành xử lý nhiệt canh trường có chứa sinh khối và EPS sinh ra bằng cách chưng nước nóng 950C trong thời gian từ 15 đến 20 phút để giải phóng lượng EPS đang còn gắn với thành tế bào của vi khuẩn, trong quá trình chưng thì lắc chai thường xuyên để nhiệt truyền đều hơn và hòa tan eps nhanh hơn, sau đó để nguội hoàn toàn đến nhiệt độ phòng. Bổ sung một lượng axit trichloacetic (TCA) vào dịch nuôi cấy nhằm kết tủa, loại bỏ protein và sinh khối vi khuẩn (xác tế bào vi khuẩn) và bảo quản lạnh trong 24 giờ, sau đó tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút để thu dịch nổi. Như vậy, có thể thấy rằng các EPS được sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn giống nhau hay các chủng vi khuẩn khác nhau nhưng được phân lập từ cùng một nguồn hoặc từ các nguồn khác nhau thì có khả năng hòa tan trong nước không giống nhau.

Sự hòa tan của các polysaccharide vào trong nước thấp có thể là do sự hình thành các mối liên kết giữa các phân tử monosaccharide để tạo thành các polymer, việc này đã làm giảm hoạt tính phân cực của các nhóm OH của đường. Ngoài ra, khả năng hoạt động của các nhóm hydroxy liền kề tương tác với nước giảm còn có thể do trong quá trình trùng hợp, các phân tử sẽ tập trung lại để tạo thành polymer. Khi phân tán đều trong thực phẩm EPS giúp ổn định cấu trúc của thực phẩm, hạn chế hiện tượng tách pha đối với một số sản phẩm dạng lỏng như sữa,các loại nước ép trái cây,….

Kiến nghị