Nghiên cứu phát triển vắc-xin viêm não Nhật Bản mới từ chủng Beijing-1

Xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán nghiên cứu phòng thí nghiệm

- Miễn dịch huỳnh quang (IF)[143]: với kháng nguyên chuẩn: Yêu cầu trước tiên kính hiển vi huỳnh quang, đây là một loại thiết bị đắt tiền và các sinh phẩm chuẩn thức quốc tế, do đó các tuyến dưới khó có thể áp dụng nếu không có kinh phí và không được đào tạo. Phòng thí nghiệm Hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã ứng dụng kỹ thuật này nhưng để nghiên cứu về virut VNNB thì các phương pháp trên đã đủ để xác định, chưa phải dùng kỹ thuật này trừ khi là một virut mới gây viêm não.

Đặc điểm lâm sàng

- Miễn dịch HVĐT (miễn dịch gắn vàng): là kỹ thuật rất đặc hiệu và chỉ những nước phát triển và các phòng thí nghiệm chuẩn thức mới thực hiện vì rất tốn kém. Bệnh VNNB thể hiện rất đa dạng: từ thể VNNB điển hình, viêm màng não nước trong đến những trường hợp nhẹ chỉ sốt, đau đầu và phần nhiều là nhiễm virut nhưng không biểu hiện triệu chứng gọi là nhiễm thể ẩn với tỷ lệ 200/1-300/1, có nghĩa là cứ 200-300 trường hợp nhiễm mới có mội trường hợp điển hình.

Dịch tễ học bệnh VNNB

Virut VNNB lưu hành rộng rãi ở hầu hết các nước trong khu vực châu Á (hình 7), bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ. Các động vật hoang dã và động vật nuôi như Lợn, Chim là vật chủ chính cho virut VNNB phát triển, người là vật chủ cuối cùng và tồn tại trong thời gian ngắn với hiệu giá virut ở máu ngoại vi rất thấp [186].

Sinh thái bệnh VNNB

Igarashi 1994, đã nghiên cứu cho thấy virut VNNB tồn tại trong thiên nhiên bởi sự phát triển kế tiếp nhau của virut trong vật chủ và vectơ, quan trọng nhất là Culex tritaeniorhynchus và một số loài muỗi khác sống ở đồng ruộng lúa nước, chỉ cần một mảnh ruộng lúa nước trong vòng 1 ngày có thể sản sinh ra 30.000 con muỗi trưởng thành. Điều này cũng chứng minh rằng tại nơi lưu hành bệnh, trong suốt thời kỳ niên thiếu, trẻ có nhiều cơ hội bị phơi nhiễm với virut VNNB và có thể đã mắc bệnh VNNB không điển hình hoặc nhiễm thể ẩn và tạo được miễn dịch cho các em.

Các biện pháp phòng chống bệnh viêm não Nhật Bản 1 Phòng chống vectơ

- Theo Igarashi nhận xét: Phải chấp nhận phương pháp phun hóa chất rộng rãi để diệt côn trùng trên đồng ruộng cũng đã làm giảm mật độ muỗi ở Nhật Bản nhưng là diệt côn trùng nói chung chứ không phải là diệt véc tơ truyền bệnh VNNB. - Ở Việt Nam, là nước 90% nông nghiệp do đó đã có ruộng lúa nước thì có vectơ truyền viêm não, theo như phân tích trên thì việc diệt vectơ bằng hóa chất là hoàn toàn không thực tế và không có hiệu quả với điều kiện kinh tế nước ta hiện nay.

Những nghiên cứu về văcxin dự phòng bệnh VNNB

80% đối tượng tiêm văcxin theo phác đồ sơ chủng 2 liều tuy nhiên 1 số tác giả nghiên cứu cho thấy hiệu quả kháng thể trung hòa giảm xuống trong vòng 6-12 tháng đến mức dưới khả năng bảo vệ (<1/10 lần) với binh lính của Mỹ thì phác đồ tiêm 3 liều sơ chủng ngày 0, ngày 7 và ngày 30 cho thấy 100% có chuyển dịch huyết thanh với hiệu giá kháng thể trung hòa cao và tồn lưu ở mức cao trong 3 năm. Hàng năm những nghiên cứu về sự thay đổi kháng nguyên trong các chủng virut VNNB lưu hành ở các nơi về các đặc tính sinh học như sự phát triển trên nuôi cấy tế bào, các thương tổn thần kinh qua thí nghiệm trên chuột, đặc tính di truyền cũng phân tích trình tự giới hạn và xếp loại phân typ đầu tiên của virut VNNB nhưng những nghiên cứu phòng thí nghiệm chưa chứng minh đầy đủ về phản ứng chéo với các chủng virut viêm não ở các thể lâm sàng khác nhau và tính gây độc thần kinh với người.

Vai trò của TCYTTG về các văcxin

Cuối cùng kết quả đã được Bộ Y tế Nhật Bản và Bộ Ngoại giao chấp nhận: chủng Beijing-1 tạo kháng thể trung hòa cao và phản ứng chéo rộng với tất cả các chủng VNNB ở các vùng khác nhau nên chọn chủng Beijing-1 thay chủng Nakayama NIH để sản xuất văcxin VNNB từ năm 1989. Mặc dù genotyp và phenotyp của virut viêm não có khác nhau chút ít và cũng cho thấy chủng Nakayama vẫn có bảo vệ với các chủng địa phương cho dù so với chủng Beijing-1 thì diện bảo vệ không rộng bằng.

Nghiên cứu phát triển văcxin mới

Chimeric-JE là một virut tái tổ hợp sống giảm độc lực điều chế bằng gen mã hóa 2 protein cấu trúc (preM và E) của virut sốt vàng 17D với gen chịu trách nhiệm của virut sống giảm độc lực VNNB SA14-14-2, protein E và preM chứa các kháng nguyên tạo được miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào, đáp ứng miễn dịch trực tiếp với VNNB [17, 32]. Một thí nghiệm chuẩn thức về độc lực thần kinh, Chimerivax-JE và YFvax được so sánh trong 10 con khỉ tiêm vào não và phân tích về bệnh sinh vi thể vào ngày 30 thương tổn vùng sừng trước của não và tủy sống ở những khỉ tiêm YFvax.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) vào các protein chuẩn và các mẫu chuẩn văcxin các ống (mỗi mẫu 3 ống, mỗi ống 1ml). - Dựng đường chuẩn protein chuẩn rồi dựa theo đường chuẩn tính hàm lượng protein trong văcxin. 3.4.7 Định lượng Thimerosal a) Nguyên lý. Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 430nm. Đo độ hấp phụ của hợp chất tạo thành ở bước sóng này. b) Chuẩn bị dung dịch. - Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng), các dung dịch thimerosal chuẩn và mẫu văcxin vào các ống, mỗi ống 0,5ml (mỗi mẫu 2 ống). Hút bỏ lớp nước ở trên. Để lắng rồi hút bỏ lớp nước ở trên. Hút bỏ lớp nước ở trên. - Thêm 1 thìa natri sulfate khan để ngừng phản ứng. - Dựng đường chuẩn thimerosal rồi dựa vào đó tính hàm lượng thimerosal trong văcxin. 3.4.8 Định lượng formaldehyt a) Nguyên lý. Định lượng formaldehyt bằng phương pháp đo cường độ màu của 3,5diacetyl 4- dihydrothidin ở bước sóng 415nm. Phức hợp này được tạo thành do phản ứng của formaldehyt chứa trong văcxin với acetylaceton và amonia trong môi trường axit nhẹ. b) Chuẩn bị dung dịch.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xây dựng quy trình chế tạo chủng gốc và chủng sản xuất (BMS và BWS)

Theo chúng tôi xét thấy: Trong nitơ lỏng nhiệt độ luôn ổn định, điều kiện pha giống và môi trường sử dụng không thay đổi, nhưng người thực hiện tiêm chuẩn độ có thay đổi, có lẽ vì vậy LD50 có giao động. Do vậy, trong 2 điều kiện bảo quản như trên, chúng ta chọn điều kiện bảo quản mẫu trong nitơ lỏng , khi đó nhiệt độ không giao động và hiệu giá virut chắc chắn sẽ ổn định hơn.

Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất văcxin VNNB từ chủng Beijing-1

Ghi chú: (A): Nước nổi sau ly tâm huyền dịch não nghiền đồng nhất 20%; (B): Nước nổi sau ly tâm huyền dịch đã xử lý protamin sulfate; (C): Nước nổi sau li tâm huyền dịch đã tủa ammoni sulfate bão hòa; (D): Văcxin bán thành phẩm đặc sau siêu ly tâm trong đệm sucrose. Thử nghiệm phân tích protein qua các công đoạn tinh chế cho thấy từ mẫu văcxin thô (mẫu A) đến bán thành phẩm đặc (mẫu D) trải qua 20 công đoạn làm tinh sạch bằng phương pháp hóa lý cho ta một sản phẩm tinh khiết mà kháng nguyên bề mặt của hạt virut VNNB vẫn còn nguyên vẹn.

Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu của 6 loạt văcxin thử nghiệm 1 Kết quả kiểm tra tính an toàn của văcxin

Chuột lang là động vật rất nhạy cảm, khi nhận bất kỳ một kháng nguyên nào vào cơ thể cũng có thể gây phản ứng nhanh và ảnh hưởng ngay đến sức khỏe, biểu hiện bằng sự giảm trọng lượng cơ thể, với chuột nhắt trắng cũng có thử nghiệm tương tự. 6 loạt văcxin đầu tiên sản xuất từ chủng Beijing-1 đã được đánh giá theo đúng thường quy kiểm định chất lượng của TCYTTG và 6/6 loạt đạt độ an toàn cao và công hiệu cao hơn mẫu chuẩn.

Toàn thân

Tuy nhiên, văcxin VNNB đều đã được sử dụng ở tất cả các tỉnh thành trong cả nước, đặc biệt ở miền Bắc, Chương trình Tiêm chủng mở rộng đã phủ gần hết các huyện có nguy cơ ở nhóm tuổi 1-5, ngoài ra các bà mẹ đều đã ý thức được tiêm văcxin VNNB là cần thiết để bảo vệ trẻ khỏi mắc bệnh VNNB nên đã tự nguyện đưa con đi tiêm dịch vụ. Tất cả đều cho thấy hiệu giá kháng thể ở HT1 càng cao thì hiệu số chuyển dịch huyết thanh càng thấp, có nghĩa là hiệu giá kháng thể trung hòa ở HT1 trước khi tiêm văcxin càng cao thì đáp ứng kháng thể càng thấp, và ngược lại HT1 (-) và càng thấp thì đáp ứng kháng thể càng cao.