Nghiên cứu khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào giống bông vải Coker312 và VN36P
MỤC LỤC
Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây.
Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005). Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó. Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây.
Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine.
Ti-plamid
Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl.
Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết.
Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv, 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA.
VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001).
Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000). Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp nghiên cứu
Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema và ctv, 1983). Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút.
Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm không có phytagel (có bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 280C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm. Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha loãng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó cấy sang đĩa petri có môi trường đồng nuôi cấy MSCo (phụ lục 2).
Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 210C trong đều kiện chiếu sáng liên tục khoảng 72 giờ. Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho khô mẫu.
Sau khi thanh lọc thì các mô sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường mannose) xuất hiện. Từ cỏc mụ sẹo sống sút sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mô sẹo phát triển tốt, có màu xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên môi trường phát sinh phôi MMS2 (phụ lục 6). Sự biến đổi hình thái mô sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong nghiên cứu này chỳng tụi tiến hành theo dừi sự thay đổi hỡnh thỏi mụ sẹo qua cỏc giai đoạn là sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc lần 3.
Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu sống sót và hỡnh thành mụ sẹo được chỳng tụi theo dừi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này chỳng ta cú thể so sỏnh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện.
