Di truyền gen axit phytic trong cây lương thực

Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp

Kiểu gen và môi trường là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lượng photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lƣợng photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lƣợng axit phytic mà các thành phần chứa photpho khác không thay đổi. Người ta đã tạo được một số gen lặn (lpa) làm giảm hàm lượng axit phytic bằng phương pháp gây đột biến bằng hoá chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do).

Có hai loại đột biến ảnh hưởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lượng axit phytic nhƣng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm giảm lƣợng axit phytic nhƣng hạt đột biến này tích lũy InsP3, InsP4 và InsP5 (Raboy và ctv., 2000). Phân tích Southern-blot, cloning, đọc trình tự gen ZmIpK từ dạng đột biến lpa2 cho thấy alen lpa2-1 đƣợc tạo ra do sự sắp xếp lại trình tự ở locus của gen ZmIpK và alen lpa2-2 đƣợc tạo ra do sự đột biến nucleotide làm xuất hiện một codon stop ở đầu N của gen ZmIpK. Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa 1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit là 510 và có tính tương đồng cao với nhiều loại cây trồng khác.

Phân tích bằng phương pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn đầu trưởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trưởng thành. P đƣợc hấp thụ bởi cây trồng sẽ đƣợc chuyển trực tiếp vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa P ở giai đoạn đầu của quá trình trưởng thành.

Quá trình sinh tổng hợp axit phytic

Những con đường này có điểm chung ở những hợp chất trung gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những chất truyền tín hiệu thứ cấp. Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đường liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns), những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P3 (Bước 6 và 7; Van der kayy và ctv., 1995; York và ctv., 1999).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Dụng cụ và hóa chất 1. Dụng cụ
• Xác định lượng photpho trong hạt bằng phương pháp sinh hoá
• Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử
• Chất tủa DNA

Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch stock của PCR buffer (10X). Dùng phương pháp tách chiết từng hạt theo Chen và ctv (1956) thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng. Thang photpho chuẩn này đƣợc thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng và dùng để so sánh với mẫu phân tích của các dòng lúa khác.

Bước 1: Lấy mỗi dòng 8 hạt, nghiền riêng từng hạt và cho từng hạt đã đƣợc nghiền vào từng giếng theo hàng dọc. Hạt càng xanh đậm đƣợc đánh giá là hạt có hàm lƣợng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lƣợng càng cao. Lấy mẫu lá: Mô lá lúa non, khỏe đƣợc lấy trên từng cá thể riêng lẻ sau khi đã gieo đƣợc 10 ngày cho vào ống tube, ghi nhãn cẩn thận và đƣợc đặt trong thùng đá.

Có thể tiến hành ly trích DNA theo những phương pháp khác đơn giản hơn, tuy nhiên phương pháp này cho ra kết quả tinh sạch hơn. Để loại bỏ tạp chủ yếu là protein sử dụng tác nhân biến tính protein ( dung dịch chloroform : isoamyl alcohol = 24:1). DNA đƣợc thu ở dạng cô đặc vừa bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của enzym vừa hòa tan lại chúng với nồng độ mong muốn.

Tủa trong isopropanol: không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol thấp ( 0,6 thể tích mẫu ). Các DNA trọng lƣợng phân tử thấp không bị tủa do đó có thể loại bỏ chúng khi tủa bằng isopropanol. Vì vậy với nồng độ muối Na thấp hơn 0,7 M thì CTAB kết hợp với DNA, phức này tan trong dung dịch nồng độ muối cao.

Ở nồng độ muối cao hơn 0.7 M, CTAB sẽ tạo phức với protein và polysaccharid mà không tạo tủa với DNA. Sau khi loại bỏ phức CTAB/polysaccharid/ protein bằng CHCl3 và phenol, DNA đƣợc phục hồi từ phần dịch nổi bằng cách tủa với isopropanol hoặc ethanol.  Sau khi tủa DNA đƣợc thu nhận lại bằng cách ly tâm, cặn đƣợc rửa bằng ethanol 70% để loại bỏ dấu vết muối, CTAB, isopropanol là những chất có thể ức chế phản ứng SSR.

Do đó SSR có thể đƣợc khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với tính phát triển của primer theo miền của hai bên trên một locus. Tuy nhiên trước khi dùng DNA, điều quan trọng là nồng độ DNA về số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng phải đƣợc kiểm tra.