Công nghệ chuyển gen: Các nghiên cứu về phương pháp và ứng dụng

Vector Adenovius

Lừi của hạt virus chứa tối thiểu 4 protein: protein đầu mút (terminal protein = TP), gắn với đầu 5’ của genome bằng liên kết đồng hóa trị; protein V (180 bản sao/hạt virus) và protein VII (1070 bản sao/hạt virus), là các protein cơ bản và protein Mu, một protein nhỏ (4kD), vị trí và chức năng chưa được biết. Adenovirus là một vector chuyển gen an toàn, có thể xâm nhiễm một cách hiệu quả vào các tế bào không phân chia và các tế bào đang phân chia của nhiều loại tế bào khác nhau do các loại tế bào đích này chứa các thụ quan phự hợp với adenovirus.

Vector episome

Vector này chứa một khởi điểm tái bản DNA (ARS 1), một tâm động (CEN 4) làm cho nó có thể phân chia vector tái bản về các tế bào con, telomere bảo vệ DNA khỏi bị suy thoái bởi exonuclease, hai gen chọn lọc (TRP 1 và UR 3) và một vị trí tạo dòng mà có thể đưa vào một đoạn có kích thước lên đến 1000kb. Điều này cho phép đưa ra giả thuyết là vector episome mang một khởi điểm tái bản hoạt động ở tế bào chuột và các gen mã hoá protein EBNA 1 và EBP 2 có thể được duy trì như vector vòng episome trong suốt đời sống của động vật và truyền lại cho thế hệ con.

Vector thay thế gen

Vector episome sẽ hoàn toàn hữu dụng cho các nhà nghiên cứu, cho việc nghiên cứu gen trong các tế bào bị nhiễm cũng như đối với liệu pháp gen và việc tạo động vật chuyển gen.

Vector sắp xếp lại các gen đích

Các enzyme này có thể được bổ sung vào trong tế bào in vitro hoặc in vivo ở động vật chuyển gen bằng cách vi tiêm trực tiếp vào tế bào chất hoặc bằng phương pháp chuyển nhiễm (transfection method) đối với protein. Hệ thống biểu hiện này đã kiểm soát bởi tetrecycline và các dẫn xuất của tetracycline, cho phép gen recombinase chỉ được biểu hiện trong một loại tế bào và chỉ khi động vật có tetracycline.

Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium 1. Sự gây ra các khối u do Agrobacterium

Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium. TR có kích thước 7 kb, được hình thành từ phía bên phải của TL-DNA trong Ti- plasmid, không phát hiện thấy trong tất cả các dòng khối u nhưng khi số bản sao của nó khác với TL người ta giả thiết là đã xảy ra một quá trình chuyển độc lập.

Cơ chế chuyển T-DNA

Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc acetosyringone tinh khiết, sản phẩm của gen vir A (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen vir C. Mô hình mô tả các sự kiện xảy ra ở mức phân tử trong sự tương tác giữa tế bào thực vật và Agrobacterium để hình thành khối u hình chóp được trình bày ở hình 1.22.

Plasmid Agrobacterium là vector biến nạp

Sau đó protein vir C đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào DNA nhân (Stachel và Zambryski, 1986).

Các thành phần cơ bản của vector Ti-plasmid không gây ung thư

Ðể nhận ra các tế bào đã được biến nạp, các gen trội kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đã được xen vào trong các trình tự lặp 25 bp dưới sự kiểm soát của T-DNA promoter và các tín hiệu polyadenyl hóa. Các gen kháng thuốc kháng sinh dạng khảm như thế biểu hiện một cách có hiệu quả trong tế bào thực vật ở bất kỳ môi trường di truyền nào.

Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid Cả A.tumefaciens và A.rhizogenes đều được sử dụng để chuyển DNA

Trước hết pBR322 mang gen cần chuyển và một marker kháng thuốc kháng sinh cho phép chọn lọc Agrobacterium (kanamycin hoặc streptomicin/spectinomycin) được đưa vào dòng Ecoli chứa hai plasmid hỗ trợ pGJ28 và pRGdrd11. Các vector nhị thể này khác nhau về kích thước, sự tái bản ổn định trong Agrobacterium, các vị trí tạo dòng, sự bổ trợ α để có thể sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên các đĩa X-GAL, các gen marker để chọn lọc các thực vật biến nạp và các gen marker để chọn lọc các thể nhận tiếp hợp, nhưng phần lớn được biết là thích hợp với một số plasmid hỗ trợ mang gen vir của A.tumefacien cũng như với nhiều Ri-plasmid.

Vector biến nạp thực vật sử dụng A.rhizogenes

Thể tái sinh từ môi trường nuôi cấy lông rễ kháng kanamicin này đã được sàng lọc đối với thực vật kiểu hình bình thường và một số đã được phục hồi mà thiếu T-DNA của A.rizhogenes nhưng có mặt T-DNA của vector nhị thể (Shalin, 1986; Trulson, 1986) là do sự chuyển độc lập của các T-DNA tách rời. Ðặc tính này của A.rhizogenes làm cho nó trở nên hấp dẫn như là một vector biến nạp nếu như quá trình này có thể được mở rộng đối với nhiều loại cây trồng khác.

Phương pháp vi tiêm

Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe. Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi tiêm dung dịch DNA vào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi.

Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus

Khi gen chuyển đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm và sau đó chúng được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Xuất phát từ lý do các tế bào gốc phôi (tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào) là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phân hoá thành bất kỳ loại mô nào và từ đó sẽ tạo nên cơ thể hoàn chỉnh.

Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện

Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào. Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nước phía trong (Hình 2.14), nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng một cách tự do (Farabee, 2001).

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn..Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Hiệu quả khuyếch đại các protein nhất định là một phương pháp có giá trị lớn đối với các nhà khoa học để nghiên cứu chức năng của các protein này (Lin, 2000). Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt.

Chuyển gen vào tinh trùng và các tiền thể của tinh trùng 1. Chuyển gen vào tinh trùng

• Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro

Tế bào gốc được tách chiết, nuôi cấy dưới những điều kiện ngăn cản sự biệt hóa của chúng, được chuyển DNA ngoại lai vào, được chọn lọc và đưa vào lại một tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệt hóa. Ðó là ở chuột, gen chuyển vào tiền thể của tinh trùng in vivo xảy ra một cách độc lập trong các tế bào khác nhau dẫn đến tạo ra các động vật sơ sinh có sự hợp nhất khác nhau.

Kỹ thuật viên gen (Gene pill)

Tuy nhiên, tính có ích của viên gen sẽ phụ thuộc vào sự biểu hiện và phân phối của gen trong các tế bào ruột non và hãy còn chưa chắc chắn là có thích hợp đối với các protein cần thiết với liều lượng khớp một cách tinh vi không. Về mặt lý thuyết, liệu pháp gen thông qua đường uống có thể phân phối gen tổng hợp bất cứ protein nào cho một loại tế bào đơn trong ruột non, đáp ứng được yêu cầu tìm ra vector hoặc chiến lược biến nạp mới cho mỗi một loại tế bào đích.

Công nghệ tạo động vật chuyển gen

Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Hiện nay các xử lý gây siêu rụng trứng sử dụng các hormone có độ tinh khiết cao đựơc sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp và đã tạo ra trung bình khoảng 10 trứng có thể phát triển đối với một lần xử lý (trong khi đó một con bò bình thường mỗi lần rụng trứng tạo ra 1 trứng có thể phát triển).

Những hướng nghiên cứu và kết quả đạt đựơc trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen 1. Những hướng nghiên cứu tạo động vật chuyển gen

Trong thập kỷ qua, nhiều dòng chuột chuyển gen đã được tạo ra như các mô hình nghiên cứu bệnh tâm thần, tim mạch, phổi, ung thư, viêm nhiễm và miễn dịch cũng như để nghiên cứu cơ chế và sự rối loạn của chuyển hoá, sự sinh sản và sự phát triển sớm ở người..(Bảng 1.5).Các mô hình này đã được chứng minh bằng các tài liệu về động vật chuyển gen trong các cơ sở dữ liệu như TBASE hoặc IMR. Ở Việt Nam, tại Phòng Công nghệ gen Ðộng vật, Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Việt Nam, Nguyễn Văn Cường và cộng sự đã và đang nghiên cứu chuyển tổ hợp gen hormone sinh trưởng người (MThGH) vào chuột, cá vàng (Carassius autarus), cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) và cá chép (Cyprinus carpio).

Ứng dụng của động vật chuyển gen

Ngoài việc góp phần tăng năng suất lên nhiều lần cho ngành nuôi trồng thủy sản, cá chuyển gen còn cung cấp các mô hình thí nghiệm tuyệt vời cho các nghiên cứu khoa học cơ bản cũng như các nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Sinh học. Bằng cách tách chiết các sợi polymer từ sữa, và bện chúng lại thành sợi các nhà khoa học có thể tạo ra một vật liệu nhẹ, bền, dẻo mà có thể được sử dụng để sản xuất các bộ quân phục đặc biệt, chỉ khâu y học siêu nhỏ, dây vợt tennis.

Một vài vấn đề nhận thức xung quanh động vật chuyển gen

Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch. Một số nước đã đề cập đến những rủi ro của nghiên cứu chuyển gen với động vật và tác động đến môi trường khi động vật chuyển gen bị sẩy ra ngoài một cách tình cờ hoặc có kế hoạch.