Kỹ thuật phân tích xác nhận phân tử bằng sinh học phân tử

Điều chế DNA khuôn 1. Phage hệ M 13mp

Những thể đã tổ hợp hình thành những plaque đục (turbid plaque), các thể không tổ hợp hình thành những plaque màu lục (blue plaque), các. thể khuyết tổn cũng hình thành plaque đục nhưng rất hiếm. *Điều chế DNA một sợi:. 1) Cho 2 ml mụi trường TY 2ì vào ống nghiệm cú nắp đó tiệt trựng. 3) Dùng que tăm đã tiệt trùng cấy plaque đục vào các ống. Cần chú ý để cấy các plaque độc lập. 5) Thu nước mặt chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. 6) Chuyển 1,3 ml dịch mặt sang ống Eppendorf mới, chú ý để dịch không lẫn tế bào vi khuẩn. Khi này có thể nhìn thấy tủa phage, đặc biệt nếu dùng rotor cố định góc (angle rotor) thì dễ nhận thấy tủa phage hơn. 11) Trộn lần nữa rồi quay li tâm ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, dùng rotor doãng góc (swing-out rotor) thì tốt hơn. 17) Làm khô tủa DNA bằng máy làm khô bằng chân không, hoặc để khô tự nhiên. 18) Hòa tan DNA vào TE, tùy lượng DNA nhiều hay ít mà thêm lượng TE thích hợp. Plasmid hệ pUC. 1) Clone hóa đoạn DNA cần xác định trình tự nucleotide vào plasmid hệ pUC, điều chế DNA plasmid bằng phương pháp kiềm (phương pháp Birnboim). 7) Quay li tâm lần nữa, loại bỏ nước mặt.

Điều chế dung dịch nucleotide cho phản ứng dideoxy

Còn nếu hoạt tính phóng xạ tương đối của [α-32P]dCTP thấp (khoảng 400 Ci/mmol) thì không cần phải làm giảm hoạt tính phóng xạ bằng dCTP phi phóng xạ.

Gắn kết DNA khuôn với mồi

Chú ý: Hai primer này bắt cặp được với các vector hai sợi nêu trên ở vị trí gần điểm kết nối vector với DNA clone hóa. Sau khi xác định được một đoạn trình tự DNA clone hóa thì dựa vào trình tự đó mà thiết kế và tổng hợp các mồi oligonucleotide mới để có thể giải trình các đoạn tiếp theo của DNA clone hóa.

Phản ứng dideoxy

Nếu với một DNA khuôn duy nhất nếu trên, có bốn ống phản ứng khác nhau mỗi ống có bổ sung chỉ một loại ddNTP và với một mồi trên thì sau khi phản ứng và điện di trên bốn làn gel khác nhau (ddA, ddT, ddG và ddC), ta có thể có các sản phẩm đánh dấu có điểm kết thúc với một nucleotide tương ứng. Nếu điện di trong môi trường có thể phân tách các đoạn này theo độ lớn của khối lượng phân tử (sản phẩm ngắn dịch chuyển nhanh hơn sản phẩm dài) và sau đó xử lý để phát hiện kết quả điện di ta sẽ xác định được trình tự các loại điểm kết thúc theo mức độ tăng dần của đoạn đường dịch chuyển của các băng ở trong gel. Kết quả có thể trình bày như hình dưới đây. Trình tự nucleotide. sản phẩm phản ứng. Kết quả điện di sản phẩm PCR các ống phản ứng với một mồi chung đánh dấu, trên bốn làn kề nhau với. bốn loại ddNTP khác nhau. ddA ddT ddG ddC. Trình tự sợi khuôn. *Phản ứng dideoxy:. Trộn đều rồi li tâm nhẹ. 6) Thờm 4 àl dịch màu trộn formamide, trộn đều.

Sequencing gel (gel giải trình)

Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel khỏi thiết bị, lấy tấm thủy tinh có tai khỏi gel (nhờ silicone mà việc lấy ra khá dễ dàng), thực hiện tự ký phóng xạ bằng một trong những phương pháp sau đây. 1) Cho gel lên bề mặt một tấm film X-quang đã sử dụng (film cũ), đậy gel bằng một tấm Saran wrap, đưa vào buồng tối và đặt lên đó một tấm film X-quang mới để thực hiện tự ký phóng xạ ở −70 ºC. Ngày nay với phát kiến ra enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq polymerase, rTaq polymerase), ddNTP nhuộm phi phóng xạ (non-RI-dyed ddNTPs như ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit của Perkin Elmer Co.), máy luân nhiệt tự động hóa (thermocycler, programmed incubator) và thiết bị quang học nhận biết bức xạ huỳnh quang đọc bản gel trong suốt quá trình điện di (như Model 307A DNA Sequencer của Applied Biosystems kết nối computer hệ Macintosh, hoặc DSQ-1000L Automated Fluorescent DNA Sequencer của Shimazu Co. kết nối computer hệ Windows..), tính phiền tạp của việc giải trình DNA giảm đi nhiều và với hiệu suất cao hơn hẳn.

Sequencing DNA với máy luân nhiệt và DNA-Sequencer tự động Với kỹ thuật mới những bước cần thực hiện hầu như không thay

Ngày nay với phát kiến ra enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq polymerase, rTaq polymerase), ddNTP nhuộm phi phóng xạ (non-RI-dyed ddNTPs như ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit của Perkin Elmer Co.), máy luân nhiệt tự động hóa (thermocycler, programmed incubator) và thiết bị quang học nhận biết bức xạ huỳnh quang đọc bản gel trong suốt quá trình điện di (như Model 307A DNA Sequencer của Applied Biosystems kết nối computer hệ Macintosh, hoặc DSQ-1000L Automated Fluorescent DNA Sequencer của Shimazu Co. kết nối computer hệ Windows..), tính phiền tạp của việc giải trình DNA giảm đi nhiều và với hiệu suất cao hơn hẳn. Nguyên lý của phương pháp như sau. Nếu bốn loại ddNTP được đánh dấu bằng bốn loại chất phát huỳnh quang khác biệt thì ta với một ống phản ứng ta có thể thu được các sản phẩm khác nhau và nếu điện di và nhận diện được bức xạ huỳnh quang khác biệt ta có thể xác định được trình tự phản ứng. Sequencing DNA với máy luân nhiệt và DNA-Sequencer tự động. Hình 10: Nguyên lý phản ứng phương pháp dideoxy đọc trình tự nucleotide với hỗn hợp bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang khác nhau. Các ddNTP gắn chất phát bức xạ cảm ứng khác nhau khi kích thích bởi UV:. ddATP gắn chất huỳnh quang phát sáng lục, ddGTP gắn chất huỳnh quang phát sáng tím xanh, ddTTP gắn chất huỳnh quang phát sáng đỏ và ddCTP gắn chất huỳnh quang phát sáng xanh lam), các mảnh DNA mang đầu huỳnh quang sẽ được lần lượt ghi lại khi dịch chuyển (nhờ điện di) qua đầu đọc (bố trí ở khoảng cách cố định so với độ dài bản gel) của máy sequencer tự động và tín hiệu tương ứng được ghi lại trong file tương ứng trong computer. pipet hoặc đổ bỏ cũng được), trỏng nhẹ tủa bằng 250 àl ethanol 75% rồi loại bỏ hoàn toàn lớp ethanol (tránh quấy vào tủa không thể nhìn thấy), làm khô. 5) Sau khi chuẩn bị gel, kiểm tra kết nối máy điện di với máy vi tính, thiết định protocol và thư mục về mẫu rồi điện di tiền khởi để kiểm tra độ sạch của bản gel (chủ yếu là bề ngoài tấm thủy tinh vùng quỹ đạo của đầu dò đọc huỳnh quang, nếu chưa sạch phải lau lại bằng isopropyl alcohol). 6) Xử lý dịch màu trộn formamide (chuẩn bị trước dung dịch loading Hình 11: Kết quả giải trình gen trên máy tự động. Phương pháp Maxam-Gilbert thực hiện đánh dấu hóa học từng phần đặc hiệu với bốn loại nucleotide (A, T, G và C). Sau đó, cắt phân tử DNA này một cách đặc hiệu tại vị trí đã đánh dấu. Cuối cùng, điện di sản phẩm phân giải DNA thu được trong gel polyacrylamide. Di động của các đoạn DNA trong điện trường phụ thuộc vào độ dài của chúng, nhờ đó xác định được trình tự nucleotide. Phương pháp này hầu như không còn được sử dụng mô tả ở đây với mục đích tham khảo. 1) Dùng polynucleotide kinase đánh dấu đầu 5' hoặc dùng enzyme Klenow đánh dấu đầu 3' của DNA bằng [32P], sau đó dùng enzyme hạn chế để cắt hoặc phân li bằng cách tách sợi (strand separation), điều chế các đoạn DNA đánh dấu một sợi. 4) Các mẫu được tiến hành đánh dấu hóa học của 5 loại base như nêu dưới đây.

Phân giải bằng piperidine và điện di trong gel

Phương pháp xác định trình tự nucleotide nằm kề đoạn ADN đã biết Phương pháp này là những vận dụng sáng tạo phản ứng PCR, clone hóa DNA là sản phẩm của PCR trong việc giải đọc trình tự nucleotide nằm ngoài đoạn DNA có trình tự đã biết. -Cắt đoạn DNA một cách ngẫu nhiên rồi kết nối lại để giảm độ dài của đoạn DNA để có thể nhân lên bằng PCR với cặp mồi ngược hướng với mồi thông thường, rồi clone hóa vào vector plasmid và giải trình đoạn đã đảo đó (xem mục "PCR đảo ngược").

Phương pháp mapping và nối dài mồi (primer)