Phương pháp cố định Enzyme Urease trên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị

Các phương pháp cố định enzyme urease

 Phương pháp cố định urease lên chất mang là màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị qua glutaraldehyde của Krajewska và cộng sự (1990) giữ lại được hơn 94% hoạt tính so với enzyme tự do.  Urease cố định trên chất mang là sợi tổng hợp từ acrylamide và poly (ethylene terephthalate) sau khi được hoạt hóa bằng glutaraldehyde (Elcin và Sacak, 1996) có độ bền khi sử dụng và khả năng tái sử dụng rất cao với khoảng hơn 85% hoạt tính ban đầu được giữ lại sau 90 ngày.

Tớnh chaỏt cuỷa enzyme urease coỏ ủũnh

 Nghiên cứu của Rao và cộng sự về cố định urease đậu rựa lên màng polymer từ gelatin và poly(HEMA) (1995) cho thấy nhiệt độ tối ưu của urease cố định dịch chuyển từ 60oC lên 70oC, trong khi đó độ bền nhiệt của urease cố định tại các nhiệt độ khác nhau thì cao hơn so với urease tự do trong cuứng ủieàu kieọn [60].  Nghiên cứu của Chen và Chiu về cố định urease từ đậu rựa trên bề mặt của các hạt chitosan xốp (1999) cho kết quả tại nhiệt độ 70oC trong đệm pH 7, enzyme cố định bền hơn so với enzyme tự do, cụ thể là enzyme tự do bị mất đi một nửa hoạt tính ban đầu sau 70 phút, trong khi đó, cần đến 175 phút thì urease cố định mới bị mất đi một nửa hoạt tính ban đầu.

NGUYEÂN LIEÄU

• Enzyme urease (EC 3.5.1.5)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gelatin dạng bột khô của hãng Merck (Đức) với các chỉ tiêu chất lượng được trình bày trong bảng 2.1. Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn sử dụng một số hóa chất khác như urea, NH4Cl, dung dịch HCl, NaOH, acid acetic… của hãng Hangzhou King Techina (Trung Quốc) và thuốc thử Nessler, đệm Tris, NiSO4 do hãng Merck (Đức) cung cấp.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Mục đích và nội dung nghiên cứu

• Khảo sát xác định phương pháp cố định enzyme urease
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị
• Khảo sát tính chất của enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị
• Các phương pháp phân tích

Tạo màng trên ống thủy tinh bằng cách rút 30 μl dung dịch enzyme – gelatin tạo màng trên ống nghiệm với chiều cao 10 mm, để khô ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, sau đó nhúng màng vào dung dịch glutaraldehyde 2.5%, lấy ra để khô và rửa lại bằng đệm để loại glutaraldehyde không liên kết, rửa lại màng bằng nước cất rồi bảo quản trong đệm phosphate ở 4oC (Hình 2.4). Hiệu quả của phương pháp cố định phụ thuộc vào lượng enzyme tạo được liên kết đồng hóa trị thông qua glutaraldehyde với chất mang và lượng enzyme liên kết này phụ thuộc vào thời gian nhúng ống thủy tinh vào dung dịch enzyme urease. Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, chúng tôi cố định các yếu tố như: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng… và thay đổi nồng độ cơ chất urea trong khoảng 0-4.5% rồi so sánh hoạt tính của urease ở những nồng độ đó.

Chúng tôi cố định các yếu tố như nồng độ enzyme, nồng độ urea, pH dung dịch phản ứng, thời gian phản ứng, cho nhiệt độ dung dịch phản ứng thay đổi từ 30 oC đến 80oC và xác định hoạt tính enzyme urease cố định và tự do ứng với mỗi nhiệt độ. • Sau các khoảng thời gian nhất định (1 tuần), chúng tôi lấy mẫu enzyme cố định và khảo sát hoạt tính của chúng để kiểm tra độ giảm hoạt tính so với ban đầu, từ đó đưa ra phương pháp bảo quản thích hợp. 2.2.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme urease tự do. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính enzyme urease bằng phương pháp Nessler. Dùng phản ứng màu với thuốc thử Nessler để định lượng ammonia được tạo thành trong phản ứng thủy phân urea bởi urease. NH3 tạo thành sẽ phản ứng với thuốc thử Nessler tạo phức màu vàng. Phức này có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 490 nm và cường độ màu thay đổi tùy theo lượng NH3 tạo ra. a) Dựng đường chuẩn NH3. • Vẽ đường chuẩn NH3 với trục tung là mật độ quang (A), trục hoành là hàm lượng NH3. b) Xác định hoạt tính. • Chuaồn bũ dung dũch urea:. • Giữ ống nghiệm trong bể điều nhiệt đến khi đạt 30 C. • Song song với bước tiến hành trên, ta chuẩn bị dung dịch urease: cân 15mg enzyme dạng bột hoàn tan trong 5ml đệm phosphate. • Thêm vào ống nghiệm 0,5ml HCl 1N để khử hoạt tính urease và làm ngừng phản ứng. • Làm đồng thời một mẫu trắng: thay dung dịch urea 2% bằng nước cất hay khử hoạt tính urease bằng 0,5ml HCl 1N trước khi cho urea vào. Đo mật độ quang của mẫu thử và mẫu trắng ở bước sóng 490nm. • Dựa vào đường chuẩn NH3, suy ra hàm lượng NH3 tạo thành. c) Công thức tính hoạt tính.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị

Đối với phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel, mặc dù hiệu suất cố định rất cao, nhưng hoạt tính enzyme cố định theo phương pháp này thấp hơn là do sự có mặt của chất mang hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất. Như ta đã biết, chitosan có bản chất là một polysaccharid có các nhóm –NH2 nên khi nhúng màng chitosan vào dung dịch GA, cũng sẽ xảy ra liên kết cộng hóa trị giữa nhóm –NH2 của chitosan và một nhóm –CHO của GA. Số lượng liên kết của 2 nhóm –NH2 trên màng và 2 nhóm –CHO của GA sẽ càng tăng (GA chỉ có 2 nhóm –CHO), làm cho lượng GA dùng để liên kết với enzyme sẽ giảm, dẫn đến lượng enzyme liên kết trên màng không nhiều, hoạt tính enzyme cố định cũng giảm theo.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch GA đến hiệu quả của quá trình cố định enzyme urease lên chất mang chitosan với các giá trị là 0.5 giờ, 1 giờ, 1.5 giờ và 2 giờ. Nguyên nhân của hiện tượng trên có thể được giải thích là nếu thời gian ngâm trong dung dịch GA càng ngắn, số lượng liên kết tạo thành giữa GA và nhóm –NH2 trên màng chitosan càng ít, dẫn đến khả năng tạo liên kết với enzyme không cao, làm hoạt tính của enzyme cố định sẽ thấp. Điều đó là vì pH acid sẽ tạo thuận lợi cho phản ứng giữa nhóm amino và nhóm aldehyde, đồng thời ở pH acid này, chitosan tồn tại ở dạng gel, giúp cho nhiều phân tử urease liên kết vào màng thông qua con đường hấp thụ hay nhốt gel [17].

Xác định hiệu suất cố định urease trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trò

Về mặt lý thuyết, theo phương trình động học Michaelis-Menten, trong một giới hạn nồng độ xác định, khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng, vượt qua giới hạn nồng độ đó vận tốc phản ứng enzyme tăng thêm không đáng kể.  Nghiên cứu cố định urease trên các chất mang khác nhau như hỗn hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ- carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy: Km của enzyme cố định lớn hơn enzyme tự do (4.3 mmol và 3.30 mmol của enzyme cố định so với 3.03 mmol của enzyme tự do), trong khi đó Vmax của enzyme tự do là 0.0182 mM/.  Kara và cộng sự (2006) nghiên cứu cố định urease trên các chất mang khác nhau như hỗn hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-carrageenan cũng kết luận rằng nhiệt độ tối thích của urease tự do và urease cố định lần lượt là 550C và 600C [ 34].

Khi cơ chất kết hợp với enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự dịch chuyển của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn đến làm thay đổi động năng cũng như thế năng của phân tử cơ chất, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát độ bền bảo quản của enzyme urease cố định trên màng chitosan trong nhiều loại dung dịch bảo quản khác nhau như dung dịch đệm photphat có bổ sung EDTA 1mM, dung dịch đệm photphat không bổ sung EDTA, dung dịch muối NiSO4 và ống thủy tinh có chứa enzyme cố định để khô. Hiện tượng giảm dần hoạt tính của enzyme urease tự do theo thời gian là do khi tồn tại trong môi trường dung dịch, các phân tử enzyme có thể tương tác với nhau, phá vỡ liên kết yếu giữa các tiểu đơn vị hình thành nên cấu trúc bậc 4 của phân tử protein, làm cho cấu trúc bậc 4 của phân tử urease bị phá hủy, enzyme bị vô hoạt.