Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn làm giảm khí metan gây hiệu ứng nhà kính
MỤC LỤC
I Loại X Verrucomicrobia Ngành Proteobacteria Proteobacteria Proteobacteria Verrucomicrobia
- CHỨNG NỘI (INTERNAL APLIFICATION CONTROL) 1. Định nghĩa chứng nội
- PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI GENE (PCR) 1. Nguyên tắc chung PCR
- TèNH HèNH NGHIấN CỨU VI KHUẨN OXY HểA METHANE 1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trong các sinh vật có cả enzyme sMMO và pMMO; khi nồng độ đồng quá cao sẽ làm chậm quá trình chuyển hóa methane nhờ enzyme sMMO của vi khuẩn và gây nên sự biểu hiện của pMMO gắn với màng intracytoplasmic; ngược lại khi nồng độ đồng thấp sẽ thúc đẩy quá trình chuyển hóa methane nhờ enzyme sMMO, biểu hiện và liên kết với methanobactins [92]. Ngoài ra, vùng gene pmoA được chứng minh có tính bảo tồn và được xem là marker tiêu biểu để phát hiện vi khuẩn: Methylocystis bryophila, Methylocystis echinoides, Methylocystis heyeri, Methylocystis hirsuta, Methylocystis parvus, Methylocystis rosea, Methylosinus sporium, Methylosinus trichosporium, Methylocapsa acidiphila, Methylocapsa aurea, Methylocapsa palsarum [68], phát hiện vi khuẩn: Methylacidiphilum fumarolicum, Methyloacidimicrobium fagopyrum, Methylomirabilis oxyfera [47],[48] bằng phương pháp PCR. Bởi vì, phản ứng PCR diễn tiến qua giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản ѕao chép tăng theo cấp số nhân, tỉ lệ lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng; các bản sao vừa được tổng hợp không thể kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
Độ tinh sạch của mẫu khuếch đại không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô: ví dụ như mẫu máu, dịch chiết tế bào….Độ nhạy của phản ứng cao: chỉ sử dụng một phân tử DNA làm khuôn cũng thu được sản phẩm nên có thể phát hiện được vi sinh vật khó nuôi cấy; việc tăng sinh là đơn giản hoặc không cần thiết. Haque và cѕ., 2018 đã nghiên cứu sử dụng cặp mồi mmoXLF2 - mmoXLR để khuếch đại gene mmoX bằng phản ứng realtime PCR và PCR nhằm phát hiện vi khuẩn: Methylocella silvestris, Methylocella palustris, Methylocella tundrae, Methylosinus trichosporium, Methylococcus capsulatus, Methylocella silvestris, Methylocella palustris [52].
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2019 tháng 07 năm 2020 tại phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh và phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Trường Đại Học Mở TP. Mẫu nước, đất lúa, nước thải biogas, mẫu dạ cỏ được thu thập tại tỉnh Vĩnh Long, Tây Ninh, Kiên Giang, Bình Dương. Nước thải 4 mẫu Hệ thống xử lí nước thải trường Đại học Mở cơ ѕở 3 Bình Dương Dạ cỏ 4 mẫu Lò giết mổ gia súc gia cầm thành.
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Các mẫu đất lúa được sử dụng làm nguồn mẫu phân tích gene đích trong nghiên cứu được xử lí bằng cách lắc trong dung dịch đêm PBS (Photphate Buffered Saline) để loại bỏ hạt đất bám dính. Mẫu nước thải, mẫu dạ cỏ, nước ѕau biogaѕ được sử dụng làm nguồn mẫu phân tích đa dạng gene đích trong nghiên cứu được xử lí trong dung dịch PBS để loại bỏ một số tạp chất không cần thiết (bụi, đất,…). Sự di chuyển này chủ yếu phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide của phân tử), kiểu cấu trúc (mạch đơn, mạch đôi, dạng sợi thẳng, vòng hay xoắn) và nồng độ của chất cấu thành gel.
Nhằm khẳng định độ chính xác và mức độ tin cậy của quá trình PCR phát hiện gene mục tiêu mã hóa cho enzyme pMMO và sMMO làm giảm khí CH4, chúng tôi tiến hành giải trình tự sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ đó chứng minh được sản phẩm PCR này mang gene mục tiêu (có thể xác định được đến loài). Các sai lệch nếu có giữa trình tự trên cơ cở dữ liệu và trình tự truy vấn cần được xem xét và kiểm tra tín hiệu huỳnh quang ở các vị trí này một lần nữa để xác nhận kết quả giải trình tự.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
- THU THẬP TRÌNH TỰ
- KHẢO SÁT CÁC CẶP MỒI
- KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 1. Kết quả tách chiết DNA
Mẫu sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu lấy từ mẫu đất trồng lúa, hố bùn ở chuồng bò, ao hồ,…Theo các nghiên cứu, mẫu sau khi phân lập, định lượng khả năng ѕử dụng khí CH4, xác định vi khuẩn mang gene mã hóa enzyme MMO từ đó tiến hành định danh chủng vi khuẩn mã hóa cho enzyme MMO. Thông tin được tổng hợp từ những công trình nghiên cứu khác nhau trên thế giới cho thấy enzyme pMMO phổ biến trên vi khuẩn Methanotrophs, có 38/44 công bố đã tổng hợp nghiên cứu gene pmoA, có 3/44 công bố đã nghiên cứu gene pmoCAB, có 2/44 công bố đã nghiên cứu gene pmoCA, có 3/44 công bố đã và nghiên cứu gene pmoC, có 1/44 nghiên cứu công bố gene pmoB mã hóa cho enzyme pMMO được thể hiện qua biểu đồ 3.1 và bảng phụ lục 2. Kết quả khai thác dữ liệu từ những công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy có 23/27 nghiên cứu đã nghiên cứu về gene mmoX mã hóa enzyme ѕMMO được thể hiện qua biểu đồ 3.2 và bảng phụ lục 3.
Mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop của mồi xuôi IAC-F là -0,34 Kcal/mol, mồi ngược IAC-R là -0,61 Kcal/mol, mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer của mồi xuôi IAC-F là -4,95 Kcal/mol, mồi ngược IAC-R là -6,34 Kcal/mol, mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hetero-dimer của mồi là -8,03 Kcal/mol đều nằm trong khoảng chấp nhận được so với các tiêu chí lý thuyết là giá trị ∆G ≥ -9 Kcal/mol. Tuy nhiên, tại vị trí mồi xuôi bắt cặp với trình tự của vùng gene 16S rRNA tham chiếu có sử dụng hai nucleotide thay thế ở vị trí 835 trên trình tự sắp gióng cột do có sự khác biệt giữa nucleotide C và T ở các trình tự, ở vị trí 836 trên trình tự sắp gióng cột do có sự khác biệt giữa nucleotide G và C nhưng mồi vẫn bắt cặp với trình tự gene đích. Trên Annhyb thể hiện hai vị trí mồi xuôi không bắt cặp với trình tự nhưng trên thực tế tại vị trí này sử dụng nucleotide thay thế nên vẫn đảm bảo mồi bắt cặp 100 % với trình tự gene đích, thu được sản phẩm khuếch đại với chiều dài 289 bp.
Mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop của mồi xuôi pmoC-F là 0,15 Kcal/mol, mồi ngược pmoA-R là -0,57 Kcal/mol, mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer của mồi xuôi pmoC-F là - 5,49 Kcal/mol, mồi ngược pmoA-R là -5,09 Kcal/mol, mức năng lượng liên kết tự do cho khả và năng hình thành cấu trúc hetero - dimer của mồi là -11,74 Kcal/mol đều nằm trong khoảng chấp nhận được so với các tiêu chí lý thuyết là giá trị ∆G ≥ - 9 Kcal/mol. Tại vị trí mồi ngược bắt cặp với các trình tự của nhóm gene pmoA tham chiếu có sử dụng ba nucleotide thay thế, vị trí 2063 trên trình tự sắp gióng cột khác nhau giữa nucleotide A, C và T; vị trí 2069 trên trình tự sắp gióng cột khác nhau giữa nucleotide A, C và T; vị trí 2072 trên trình tự sắp gióng cột khác nhau giữa nucleotide T và C ở các trình tự. Trên Annhyb thể hiện hai vị trí mồi xuôi, ba vị trí mồi ngược không bắt cặp với trình tự nhưng trên thực tế tại vị trí này sử dụng nucleotide thay thế nên vẫn đảm bảo mồi bắt cặp 100 % với trình tự gene đích.
Mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop của mồi xuôi mmoX-F là -0,63 Kcal/mol, mồi ngược mmoX-R là 1,51 Kcal/mol, mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer của mồi xuôi mmoX-F là -5,38 Kcal/mol, mồi ngược mmoX-R là -4,99 Kcal/mol đều nằm trong khoảng chấp nhận được so với các tiêu chí lý thuyết là giá trị ∆G ≥ -9 Kcal/mol. Tuy nhiên, tại vị trí mồi xuôi bắt cặp với các trình tự của nhóm gene mmoX tham chiếu có sử dụng một nucleotide thay thế ở vị và trí 764 trên trình tự sắp gióng cột có sự khác biệt giữa nucleotide A và G ở các trình tự; tại vị trí mồi ngược bắt cặp với các trình tự của nhóm gene mmoX tham chiếu có sử dụng hai nucleotide thay thế ở vị và trí 1160 trên trình tự sắp gióng cột có sự khác biệt giữa nucleotide T và C ở các trình tự, ở vị và trí 1163 trên trình tự sắp gióng cột có sự khác biệt giữa nucleotide A, C và G. Annhyb thể hiện hai vị trí mồi xuôi không bắt cặp với trình tự nhưng trên thực tế tại vị trí này sử dụng nucleotide thay thế nên vẫn đảm bảo mồi bắt cặp 100 % với trình tự gene đích.
Tuy nhiên, tại vị trí mồi xuôi bắt cặp với trình tự của vùng gene 16S rRNA tham chiếu có sử dụng hai nucleotide thay thế ở vị trí 332 trên trình tự sắp gióng cột do có sự khác biệt giữa nucleotide C và T ở các trình tự, ở vị trí 336 trên trình tự sắp gióng cột do có sự khác biệt giữa nucleotide G và A nhưng mồi vẫn bắt cặp với trình tự gene đích. Hay nói cách khác quá trình tách chiết DNA từ các mẫu thí nghiệm thành công và sản phẩm tách chiết DNA mẫu DL1.1 được sử dụng để tối ưu hóa cặp mồi IAC-F, IAC- R giúp khuếch đại đoạn trình tự 16S rRNA.
