Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên qua lòng đỏ trứng gà phòng chống bệnh tiêu chảy ở lợn
MỤC LỤC
Yếu tố xâm nhập của E. coli
Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đợc hàng rào này sẽ bị bắt bởi đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [2], [6].
Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên
Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli
Khối lợng phân tử của heamolyzin khoảng 300.000 Da, đợc cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [63].
Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV)
Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli
Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp [19]. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E.
Độc tố của E. coli
Để phòng bệnh, giá trị dinh dỡng của thức ăn có thể đợc giảm bớt nhờ tăng hàm lợng chất xơ lên 15- 20%, giảm protein thô và năng lợng tiêu hóa còn một nửa giá trị trong khẩu phần bình thờng, cung cấp mức dinh dỡng thấp chỉ đủ để duy trì tăng trọng hàng ngày nhỏ hơn 1% khối lợng cơ thể trong 2 tuần sau cai sữa. - Kháng thể (tiếng Anh: antibody): là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng nh các tơng bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virut.
Đặc tính và ứng dụng
Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đề hấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loại kháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinh kháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó. Tuy nhiên, ta không thể có đủ lợng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhng có một điều thú vị là kháng thể trong huyết thanh gà lại đợc truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà [36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh đợc các bệnh tật. Ngày nay, ngời ta đã chứng minh và có nhiều bằng sáng chế về sản xuất kháng thể trong lòng đỏ trứng, cho đến nay ngời ta đã đợc xác định đợc bản chất của kháng thể đó là IgY do các tài liệu khác còn gọi là: IgG gà (chicken IgG), IgG lòng.
Vật liệu và phơng pháp
- Động vật thí nghiệm
Bệnh phẩm là phủ tạng lợn đợc lấy bằng cách đa cả con lợn bị phù đầu đã chết hoặc gần chết về phòng thí nghiệm, mổ lấy bệnh phẩm gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, ruột, gan, lách, phổi trong trực tràng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Chọn khuẩn lạc có dạng S, có màu vàng đặc trng trên môi trờng thạch Istrati cấy sang môi trờng Mac Conkey và môi trờng Brilliant green agar bồi dỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chất mọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết. Trong môi trờng dinh dỡng Nutrient Broth đã bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch đờng cần kiểm tra, cấy vi khuẩn vào, bồi dỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả.
Kết quả và bàn luận
Nuôi cấy đặc hiệu cho E. coli, sàng lọc vi khuẩn tạp
Kết hợp với các môi trờng khác nh là môi trờng thạch máu, môi trờng nớc thịt, môi trờng thạch thờng, môi trờng yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm giống với E. Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ 85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với E. Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên tiêu bản khi nhuộm Gram: vi khuẩn có dạng trực khuẩn, hai đầu tròn, bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ.
Tiến hành các phản ứng sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập đợc
Sau khi xác định khả năng dung huyết của các chủng, chúng tôi cấy 50 chủng này vào môi trờng thạch bán lỏng trong ống nghiệm chữ U (cấy ở một đầu ống nghiệm) nuôi ở điều kiện 37oC, cứ sau 6 tiếng đọc kết quả 1 lần. Mẫu dơng tính là mẫu mà vi khuẩn có khả năng phát triển ra môi trờng xung quanh và phát triển sang nhánh bên của ống nghiệm chữ U. Còn mẫu âm tính là mẫu mà vi khuẩn không có khả năng phát triển ra môi trờng xung quanh, chúng chỉ có thể phát triển tại vị trí cấy giống, sau đây là kết quả cụ thể.
Định typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn phân lập đợc
Xác định độc lực của từng chủng E. coli đã phân lập
Ngoài ra, kết hợp với Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ơng, sử dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi còn xác định đợc sự có mặt của các gen độc tố của E. Nh vậy, từ 29 chủng đã phân lập đợc, qua việc xác định độc lực của từng chủng. Chúng tôi đã chọn lọc ra đợc 13 chủng có độc lực, tiếp theo chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu tính kháng nguyên của các chủng này.
Xác định tính kháng nguyên của từng chủng E. coli đã phân lập
Nh vậy, từ 29 chủng đã phân lập đợc, qua việc xác định độc lực của từng chủng. Chúng tôi đã chọn lọc ra đợc 13 chủng có độc lực, tiếp theo chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu tính kháng nguyên của các chủng này. kháng thể từ 1/48 trở lên), thể hiện tính kháng nguyên tốt của các chủng E. + Trong số 13 chủng này chỉ có 3 chủng có tính kháng nguyên rất yếu, thể hiện qua hiệu giá kháng thể trong huyết thanh chuột không cao hơn nhiều so với huyết thanh của chuột đối chứng, đó là các chủng E15, E20, E24, do đó chúng tôi tạm thời loại bỏ chủng này. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này ngoài việc chế tạo kháng thể chống lại các kháng nguyên thân của vi khuẩn, còn phải chế tạo đợc các kháng thể đặc hiệu để trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Nghiên cứu động thái sinh trởng của E. coli
Để có thể chế tạo đợc kháng thể kháng độc tố, bớc đầu tiên là chế tạo đợc kháng nguyên độc tố an toàn để miễn dịch cho động vật thí nghiệm. Nghiên cứu môi trờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố.
Nghiên cứu môi trờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố E. coli
Sau khi nuôi cấy trên các môi trờng có các công thức nuôi cấy khác nhau, dịch nuôi cấy sống đợc ly tâm ở 7000g/15 phút, thu phần nớc trong, lọc qua màng lọc có kích thớc lỗ lọc 0,2 μm, dung dịch thu đợc sau khi lọc gọi là dịch chứa độc tố, ký hiệu là T2, chúng tôi tiến hành tiêm dịch qua lọc T2 cho chuột bạch 18 – 20 gam. Tiếp theo chúng tôi kiểm tra hiệu quả giải độc của các phơng pháp trên bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt, lấy nớc trong lọc qua màng 0,2 àm thu đ- ợc dịch lọc gọi là “giải độc tố”, sau đó tiêm giải độc tố đó cho chuột bạch 18 - 20 gam với liều tiêm 0,4 ml vào tĩnh mạch và so sánh với tiêu chuẩn độc tố ở trên (tiêu chuẩn để đánh giá độc tố E. + Phơng pháp giải độc bằng phenol và thiomersal không những không mang lại hiệu quả giải độc mà còn làm tăng tính độc của độc tố, do đó không thể dùng hai hóa chất này để giải độc đợc.
Kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt
Dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc, độc lực giảm đi nhng vẫn có tính kháng nguyên.
Xác định tính kháng nguyên của giải độc tố
Phản ứng ADP dơng tính một lần nữa khẳng định chắc chắn về tính kháng nguyên của độc tố, ngoài ra ta còn xác định đợc hiệu giá kết tủa, nghĩa là kháng nguyên độc tố gây miễn dịch mạnh. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hiệu lực của hai sản phẩm trên bằng cách miễn dịch liều 0,4ml/con theo đờng tiêm dới da trên chuột bạch và so sánh với đối chứng (đối chứng là chuột miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ). Sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành lấy máu chuột, chắt huyết thanh, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngng kết nhanh trên phiến kính. Kết quả cụ thể nh sau:. Bảng 21: Kiểm tra tính miễn dịch của kháng nguyên có bổ sung các chất bổ trợ Chất bổ trợ Nồng độ Hiệu giá từng con Hiệu giá trung bình. chất bổ trợ). Kết quả trên cho thấy, kháng huyết thanh của những động vật thí nghiệm đợc miễn dịch kháng nguyên có thêm chất bổ trợ alum 2 0/00 có hiệu giá cao hơn so với huyết thanh của những con đối chứng (đợc miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ).
Khảo sát độ vô trùng của sản phẩm
Theo dõi các chỉ tiêu cảm quan 03 lô sản phẩm; mỗi lô 20 mẫu trong vòng 06 tháng, chúng tôi thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu sản phẩm ở điều kiện bảo quản khác nhau.
Khảo sát hiệu giá kháng thể trong sản phẩm
Hiệu giá kháng thể trong sản phẩm không thay đổi trong suốt thời gian bảo quản.
Khảo sát độ an toàn của sản phẩm
Đặng Xuân Bình (2004), Vai trò của vi khuẩn Escherichia coli và Clostridium Perfringens trong bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ, các biện pháp phòng trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. (1993), "Comparison of four purification methols for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain", Journal of Immunological methols, (160), pp.207- 214. "Genotypic prevalence of the fimbrial adhesins (F4, F5, F6, F41 and F18) and toxin (LT, STa, STb, and Stx 2e) in Escherichia coli isolated from postweaning pigs with diarrhoea or oedema disease in Korea", Vet.
