Ứng dụng dịch tiết từ sán lá gan lớn Fasciola gigantica trong chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn

Hoạt động protease

Thành phần chủ yếu của dịch tiết là cysteine-protease trong thời gian ký sinh đóng vai trò chủ chốt trong việc xâm nhập bệnh vào cơ thể ký chủ. Các enzyme này giúp phân giải thành phần protein của ký chủ để cung cấp dinh dưỡng cho sán phát triển và để tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của ký sinh trùng qua ruột non và gan. Mặt khác, chúng còn bất hoạt hàng rào bảo vệ miễn dịch của tế bào chủ bằng sự phân cắt các immunoglobulins.

Do đó, việc xác định và tinh chế thành phần protease này có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và gia súc. Các thử nghiệm tạo vaccine từ các loại protease trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn ở giai đoạn non và trưởng thành đã được thực hiện cho thấy có kết quả tốt tác động lên sự dinh dưỡng và phát triển của ký sinh trùng cũng như hạn chế số lượng trứng trong phân. Từ đó kiểm soát được sự lan nhiễm của bệnh và hạn chế mức thiệt hại về kinh tế [10].

Vật liệu

• Đối tƣợng nghiên cứu

Trộn đều bột màu với hai dung môi hữu cơ này để hòa tan trước khi cho nước vào, 300 ml nước. (Có một số bột màu có giá bột thủy tinh, không tan được phải lọc qua Whatman số 1). Để hãm tốc độ polymer hóa, các dung dịch monomer cần cho xuống 40C trước khi thực hiện gradient.

Dung dịch gel agarose 1% pha trong đệm PBS 1X để làm phản ứng miễn dịch khuếch tán kép trên thạch.

Phương pháp

Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein- Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di;. Với các tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein đều được tích điện âm. Do đó, có sự liên quan giữa trọng lượng phân tử của protein với tốc độ di chuyển của các protein trong môi trường có SDS cho đường biễu diễn tuyến tính log.(M.W.) = ax + b (chiều dài đường di).

Công thức này cho thấy trọng lượng phân tử (M.W) càng lớn, đường đi càng ngắn, tức a < 0 và cắt các cầu nối S-S là cần thiết để đảm bảo quy luật trên. Tốc độ di chuyển của một protein trong phương pháp điện di dựa trên sự khác nhau về điện tích, kích thước lỗ gel, trọng lượng phân tử, cường độ điện trường, thời gian điện di, nhiệt độ…. Các thành phần được sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là acrylamide, N,N’-methylene-bis (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate.

Khi điện di các phân tử protein được di chuyển từ cực âm sang cực dương và đồng thời cũng là di chuyển từ lớp gel có khoảng trống của lưới phân tử to đến lớp có khoảng trống của lưới phân tử nhỏ. Trong thực tế để xác định trọng lượng phân tử của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã được biết. Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di gel không liên tục.

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử sau khi xác định được nồng độ sẽ được trộn với dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1:1 và xử lý mẫu bằng cách đun cách thủy trong vòng năm phút.  Trường hợp điện di để xác định hoạt tính protease trong dịch tiết của sán lá gan ta tiến hành tương tự chỉ khác là thêm cơ chất gelatine 0,1% vào gel phân tách và không có xử lý mẫu để tránh làm biến tính protease trong mẫu. Nếu tạo thành một đường kết tủa dạng “cựa gà” cho thấy hai loại kháng nguyên có chung một quyết định kháng nguyên nhưng cũng có những quyết định kháng nguyên khác nhau, nghĩa là giống nhau chỉ một phần.

 Chuẩn bị kháng thể (IgG): Kháng thể kháng Fasciola sp dưới dạng tủa trong (NH4 )2 SO4 45%S được thẩm tích trong dung dịch NaN3 0,05% một lần và trong dung dịch đệm PBS hai lần nhằm loại hết ammonium sunfate.  Cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B: Cho dung dịch kháng nguyên tiết pha trong đệm carbonate vào gel đã trương nở (theo thể tích là 1:. 1), lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng để qua đêm, tiến hành ly tâm thu dịch nổi đem đo OD280 nhằm kiểm tra hiệu suất gắn vào gel của kháng nguyên tiết. Nén cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B vào cột: Cho hỗn dịch gel vào becher sạch, khuấy đều hỗn dịch rồi dùng pipet hút lên cho vào.

Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (Sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – Streptavidin – enzyme sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp.