Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng enzyme xylanolytic và cellulolytic từ vi khuẩn ưa nhiệt trong xử lý chất thải lignocellulose

Enzyme thủy phân lignocellulose

Phương pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa hai phương pháp truyền thống, nó bao gồm các quy trình hóa học trên cơ sở hoạt động của các chất xúc tác có bản chất sinh học. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Phương pháp xử lý bằng enzyme so với phương pháp xử lý thông thường có những ưu điểm vượt trội như: áp dụng được đối với các hợp chất sinh học khó xử lý; tác dụng ở cả vùng nồng độ chất ô nhiễm cao và thấp; một số enzyme riêng biệt có tác dụng trên phạm vi của pH, nhiệt độ, độ mặn…; không gây ra những biến động bất thường; không ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái.

Dựa trên phương pháp enzyme học về quá trình phân hủy cellulose, hemicellulose và lignin ngày nay đã có một vài phương pháp sinh học thực hiện chu trình xử lý. Trong tương lai gần, các quy trình sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose hoặc dựa vào vi sinh vật có thể mang lại cho chúng ta nhiều lợi ích lớn và thân thiện với môi trường. Đó có thể là do các phân tử tại các liên kết cellulose-hemicellulose hoặc tại các vùng cellulose tinh thể đòi hỏi phải có các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn.

Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose. Các vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trường riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác như nấm và vi khuẩn. Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác.

Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose. Như vậy, sự phân giải polysaccharide phức tạp như vậy có thể gồm hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme xylanolytic [7].

Có hai loại enzyme arabinase, các enzyme α-L-arabinofuranosidase ngoại bào (EC 3.2.1.55) hoạt hóa ngược lại với p-nitrophenly-α-L-arabinofuranoside và trên các arabinan phân nhánh, và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase nội bào (EC3.2.1.99), chỉ hoạt hóa các arabinan dạng thẳng. Enzyme này không tác động đối với α-L-1,3 hoặc α-1,5 liên kết arabinose từ arabinan, arabinogalactan, hoặc p- nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside. Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [8].

Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic

Trong các nghiên cứu trước đó đã chứng minh được enzyme này được chứng minh là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm [20,31].

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp nghiên cứu

• 1 thể tích tương đương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol tỉ lệ 25:24:1 được bổ sung, lắc mạnh bằng vortex trong 30 giây. Phương pháp này cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN đồng thời kiểm tra độ tinh sạch của mẫu ADN tách chiết. Hỗn hợp được trộn đều, chuyển vào máy PCR và tiến hành chạy với chế độ nhiệt: 94oC trong 3 phút để làm biến tính hoàn toàn ADN khuôn, tiếp theo là 35 chu kỳ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94oC trong 1 phút để biến tính ADN, 60oC trong 1.

Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ ở nhiệt độ 22oC trong 3 giờ và được giữ ở 4oC cho đến khi biến nạp vào tế bào khả biến E. Hỗn hợp phản ứng gắn ở trên được bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào. - Chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR cho xác định trình tự: Sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S được pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol).

Sau khi ủ ở nhiệt độ 50oC trong 15 phút, quá trình giải phóng đường khử được định tính theo phương pháp Somogyi-Nelson [38] với đường xylose làm tiêu chuẩn. Hoạt độ enzyme cellulase được xác định như phương pháp xác định enzyme xylanase ở trên và sử dụng cacboxymethyl cellulose (CMC) làm cơ chất và đường glucose làm tiêu chuẩn. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme phân giải cơ chất thành đường khử tương đương 1μmol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.

Hoạt độ enzyme β-xylosidase: môi trường định tính hoạt độ enzyme gồm 0.9 mM p-nitrophenyl β-D-xylopyranoside trong đệm phosphate 50 mM, pH 7 rồi đưa đến thể tích cuối cùng 1,1 ml. Hoạt độ enzyme β-glucosidase và arabinofuranosidase được xác định tương tự như xác định hoạt độ enzyme β-xylosidase, nhưng thay cơ chất bằng 1 mM p-. Hoạt độ của xylanase và cellulase tại giá trị pH khác nhau được xác định bằng cách sử dụng cơ chất xylan lúa mạch cho enzyme xylanase và CMC cho cellulase.

Nồng độ protein được xác định theo phương pháp của Lowry và các cộng sự [22] với albumin huyết thanh của bò làm chất chuẩn. Cỏc chất lignocellulose như vỏ ngụ, lừi ngụ, và bó mớa được xay nhuyễn và rửa vài lần với nước cất ấm đã khử trùng để loại bỏ đường tự do còn lại. Tại thời gian nhất định, sản phẩm thủy phân được thu nhận và lượng đường khử giải phóng được xác định bằng phương pháp Somogyi-Nelson [38].

Để thu các protein liên kết cellulose (chủ yếu là phức hệ multienzyme), dịch thô được ủ lắc với vỏ ngô xay nhuyễn ở 4oC trong 30 phút. Độ sạch cũng như khối lượng phân tử của chế phẩm enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS (SDS-PAGE) của Laemmli [19], sử dụng nồng độ gel cô là 5% và gel tách là 12%, nhuộm băng bằng.