Phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate và Vitamin C trong dưa leo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

MỤC LỤC

Vai trò của Vitamin C: [1]

Để giữ được Vitamin C, người ta thêm một số chất ổn định, ví dụ đường saccharose, acid hữu cơ, sorbitol, glycerine hoặc một số hợp chất của anthocyane, flavonoide. Nó rất cần thiết cho cơ thể để tăng sức đề kháng và chống lại các hiện tượng choáng hoặc ngộ độc bởi các hóa chất cũng như các độc tố của vi trùng.

Các phương pháp phân tích hàm lượng Vitamin C

• Phân tích bằng phương pháp HPLC: [2] phương pháp này được giới thiệu trong nhiều tài liệu tham khảo và đã trở thành một bài thí nghiệm trong PTN Hóa sinh, Bộ môn CN thực phẩm. Mẫu rau quả được nghiền trong dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 để trích Vitamin C ra, pha loãng theo tỷ lệ thích hợp rồi phân tích như với các mẫu chuẩn.

Dửa leo: [17]

Đặc điểm của quả dưa leo

Khi chuyển từ non đến chín, quả có màu xanh đến xanh trắng, vàng hay nâu phụ thuộc vào màu gai quả.

Sử dụng dưa leo

Tình hình sử dụng dưa leo ở một vài nước trên thế giới: ở Mỹ, việc tiêu thụ dưa leo dạng muối chua đang giảm xuống mà chuyển sang sử dụng dưa leo tươi, chưa qua chế biến.

Bảng 1.3: Thành phầân dinh dưỡng trong 100g dưa leo (luôn vỏ).

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): [2]

Thieát bò HPLC

Các loại đầu dò thông dụng là đầu dò UV–VIS, đầu dò huỳnh quang, đầu dò dẫn nhiệt, đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI)… Sự thay đổi về cường độ ánh sáng do sự hấp thu tia UV, sự phát xạ huỳnh quang, … sẽ được ghi nhận lại thông qua hai thông số là thời gian lưu và diện tích peak trên sắc ký đồ. • Bộ nạp mẫu: bộ nạp mẫu trong HPLC thường được thiết kế phù hợp với hai kiểu bơm mẫu: bơm cùng với dòng dung môi hoặc bơm mẫu vào cột tách trong điều kiện dòng dung môi ngưng lại không chịu áp suất, thường sử dụng khi thiết bị phải làm việc ở áp suất rất cao.

THỰC NGHIỆM

Vận hành thiết bị
Tieỏn trỡnh thớ nghieọm

Nói chung khi nồng độ thấp thì ta nên sử dụng ATTEN nhỏ, nếu nồng độ quá lớn mà đặt ATTEN nhỏ thì peak chỉ được biểu diễn một phần nhưng điều này không ảnh hưởng đến việc tính toán diện tích hay chieàu cao peak. Tiến hành quét phổ dung dịch Carbaryl trong 55%Acetonitrile/45% nước, dung dịch Dimethoate trong 55%Acetonitrile/45% nước, dung dịch Vitamin C trong hệ đệm phosphate. Từ đó so sánh giữa độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn trực tiếp lên rau và khi bổ sung vào dịch trích, kết luận ảnh hưởng của quá trình trích và lọc đến độ thu hồi maãu.

Xác định diện tích peak các mẫu không bổ sung, có bổ sung Vitamin C trên rau và mẫu Vitamin C trong nước có cùng nồng độ tương đương để so sánh xác định độ thu hồi mẫu. Chuẩn bị mẫu chiếu xạ: cân 100g dưa leo, tẩm thêm Carbaryl vào mẫu dưa đã cân sẵn với lượng gấp đôi dư lượng tối đa cho phép trên dưa leo (6mL dung dịch Carbaryl 100ppm), để qua đêm để thuốc ngấm vào rau, sau đó đem mẫu đi chiếu xạ. Chuẩn bị mẫu dưa leo tương tự như trên nhưng chỉ tẩm thêm Carbaryl vào các mẫu rau với lượng bằng dư lượng tối đa cho phép trên rau (3mL dung dịch Carbaryl 100ppm lên 100g dưa leo), để qua đêm và đem mẫu đi chiếu xạ.

Phổ hấp thu của Carbaryl trong acetonitrile/ nước (55/45)

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động acetonitrile/nước lên thời gian lưu và diện tích peak của chuẩn Carbaryl, Dimethoate

Dựa vào hai bảng số liệu trên nhận thấy khi tăng tỉ lệ acetonitrile trong thành phần pha động lên thì thời gian lưu của cả Carbaryl và Dimethoate đều giảm xuống, còn diện tích peak thì tăng lên. Do acetonitrile là dung môi để rửa cột nên khi tăng hàm lượng acetonitrile trong thành phần pha động thì tốc độ rửa giải Dimethoate và Carbaryl ra khỏi cột nhanh hơn, do đó thời gian lưu sẽ ngắn hơn. Còn khi giảm lượng acetonitrile thì thời gian lưu tăng lên, đặc biệt là đối với Carbaryl thời gian lưu tăng lên đến 11,374 phút, đồng thời peak ra có dạng không đối xứng.

Mặt khác, thời gian lưu cũng không nên quá dài vì mất nhiều thời gian phân tích, hao tốn nhiều dung môi và giảm độ thu hồi mẫu bởi tương tác của mẫu với pha tónh.

Kết quả đường chuẩn xác định nồng độ Carbaryl, Dimethoate trong nước

Ở đây trong luận văn này sẽ sử dụng hệ pha động acetonitrile/nước có thành phần 55/45 để phân tích cả Carbaryl và Dimethoate. Thời gian lưu của Carbaryl và Dimethoate với thành phần pha động này không quá dài nên tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi. Diện tích peak thu được có độ lệch chuẩn tương đối chấp nhận được (đối với Carbaryl là không quá 3,58%; còn đối với Dimethoate là không quá 4,52%).

Sử dụng phần mềm tính toán Excel để rút ra đường thẳng hồi qui thể hiện diện tích peak theo nồng độ mẫu trong vùng nồng độ khảo sát.

Hình 3.3: Đường chuẩn phân tích Carbaryl với thiết bị HPLC - UV

Xác định độ lặp lại và độ thu hồi mẫu khi phân tích bằng HPLC

Điều này có thể giải thích được là do cột HPLC chỉ giữ lại một lượng Carbaryl nhất định ở các nồng độ khác nhau, do đó chỉ một lượng nhỏ bị giữ lại trên cột cũng ảnh hưởng mạnh đến kết quả đo của các mẫu nồng độ thấp. Kết quả độ thu hồi qua cột của Carbaryl là khá cao (ở nồng độ 10ppm đạt 98%), chứng tỏ Carbaryl có thể rửa giải hết ra khỏi cột phân tích khi sử dụng hệ pha động acetonitrile/nước tỉ lệ 55/45. Độ thu hồi mẫu qua cột của Carbaryl cao hơn rất nhiều so với các mẫu Dimethoate, điều này chứng tỏ hệ pha động acetonitrile/ nước với thành phần 55/45 rửa giải Carbaryl ra khỏi cột tốt hơn nhiều so với rửa giải Dimethoate.

Tuy nhiên để thuận tiện trong quá trình thí nghiệm, tạo sự ổn định cho cột phân tích, giảm thời gian rửa cột khi thay pha động, trong luận văn này chỉ dùng một hệ pha động 55/45 để phân tích cả 2 chất.

Bảng 3.3: Độ thu hồi qua cột HPLC của Carbaryl

Kết quả thử nghiệm quy trình trích Carbaryl từ dưa leo

Kết quả lựa chọn dung môi: phương pháp của AOAC dùng cho sắc ký lỏng cao áp sử dụng dung môi methanol, tuy nhiên khi thực hiện như trong hướng dẫn của phương pháp này thì điều bất ngờ là ngay trong lần trích ly bậc 1 đã không thể tách pha mặc dù đã bổ sung khá nhiều muối. Kết quả xác định số bậc trích ly: phân tích hàm lượng Carbaryl trong pha nước sau bậc trích ly thứ nhất và bậc trích ly thứ 2, và thứ 3 để đánh giá xem có nên thực hiện nhiều bậc trích ly nhằm tăng độ thu hồi của Carbaryl hay không. Nhằm hạn chế sai số thực nghiệm, nâng cao hiệu suất thu hồi mẫu, các thí nghiệm xác định độ thu hồi của qui trình trích ly Carbaryl từ rau được thực hiện đồng thời với các mẫu rau không thêm chuẩn và các mẫu rau được bổ sung thêm chuẩn Carbaryl trong phòng thí nghieọm.

Điều này có thể giải thích được là do đã cải tiến qui trình trích Carbaryl từ rau: sử dụng lượng nguyên liệu lớn hơn (100g), tiến hành trích ly nhiều bậc hơn, tráng bình cô quay nhiều lần bằng acetonitrile để nâng cao hiệu suất thu hồi Carbaryl từ rau.

Bảng kết quả trên cho thấy ở bậc trích ly thứ 3, độ thu hồi mẫu tăng lên không đáng kể, nhưng lại tốn khá nhiều thời gian để chuẩn bị mẫu, nên quyết định chỉ trích ly hai bậc, xả bỏ pha nước sau lần trích ly thứ hai, kết quả này cũng phù hợp với phương

Kết quả thử nghiệm quy trình trích Dimethoate từ dưa leo

Tương tự như đối với Carbaryl, kết quả phân tích hàm lượng Dimethoate trong rau chịu ảnh hưởng của hiệu suất thu hồi mẫu sau cột HPLC và hiệu suất thu hồi mẫu sau quá trình trích (trước khi đưa vào cột HPLC). Do đó, để xác định hiệu suất thu hồi mẫu của qui trình trích lựa chọn, cần làm đồng thời qui trình này với mẫu rau, và với mẫu rau có thêm chuẩn để so sánh. Cũng tương tự như Carbaryl, độ thu hồi mẫu Dimethoate khi bổ sung vào dịch trích rau cao hơn so với độ thu hồi mẫu khi bổ sung trực tiếp trên rau.

Khi đưa mẫu phân tích ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông Dược VIPESCO, do ở đây có thêm bước làm giàu mẫu qua cột nên độ thu hồi mẫu qua cột đạt được rất cao (91,6%).

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ thu hồi Dimethoate từ rau khi bổ sung 2,5; 5; 10mL dung dịch Dimethoate 100ppm vào rau.

Kết quả độ thu hồi mẫu của quy trình trích Vitamin C trong dưa leo

Cũng tương tự như Carbaryl, Dimethoate thì độ thu hồi qua cột của Vitamin C cũng tăng khi nồng độ tăng. Kết quả độ thu hồi mẫu đạt được khá cao, tương đương với kết quả trong tài liệu [6]. Tương tự như Carbaryl, Dimethoate độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn vào dịch trích cao hơn khi bổ sung chuẩn trực tiếp lên rau, giải thích tương tự là do thất thoát trong bã khi lọc.

Kết quả xác định hàm lượng Vitamin C trong dưa leo

Ở đây có nhiều nguyên nhân, trước hết là do giống dưa leo chọn phân tích, khác với trong tài liệu. Thứ hai là do mất mát Vitamin C trong quá trình thu hoạch và bảo quản (khoảng thời gian từ lúc thu hoạch đến khi phân tích). Kế tiếp là do sự mất mát Vitamin C trong quá trình phân tích, thời gian phân tích lâu và điều kiện bảo quản không tốt cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Vitamin C.

Ngoài ra, cũng có thể do quy trình trích ly cho hiệu suất thu hồi cao đối với Vitamin C mới cho vào rau hơn là Vitamin C có trong rau.

Kết quả chiếu xạ ở liều chiếu bằng và thấp hơn ngưỡng cho phép

ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ PHÂN HỦY CARBARYL KHI CHIẾU XẠ.