Khả năng sinh enzym cellulase từ nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Vật liệu

Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thô. Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phóng ra đường khử (như glucose) khi thủy phõn CMC ở tốc độ 1àmol/phỳt dưới các điều kiện phản ứng.  Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt.

Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng tròn trong suốt (vòng vô khuẩn) xung quanh lỗ khoan. - Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong nước biển, glucose lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon: lactose, sucrose, maltose, sorbitol, galactose.

Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng, sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày, đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các KL bằng cách đo đường kính KL d (mm).

Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ

Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác lá, thân, cành, động vật, vỏ xác tôm cua, giáp xác…đang bị phân hủy. Do nguồn thức ăn chủ yếu của nấm sợi sống trong RNM Cần Giờ là lá cây, nên chúng phải có khả năng tổng hợp enzym cellulase để phân giải các hợp chất cellulose khó phân hủy. Ta thấy trên đất ngoài thức ăn là lá, thân cành rụng, còn có nhiều thành phần khó phân giải như rác rưởi, vỏ tôm cua, xác động vật….Nấm sợi phải cùng lúc tổng hợp nhiều loại enzym khác như protease, amylase, kitinase để phân hủy các thành phần này.

Thực tế, quá trình phân giải các hợp chất chứa cellulose trong tự nhiên diễn ra rất chậm, không chỉ dựa vào hệ nấm sợi mà phải có sự tham gia của các VSV khác như vi khuẩn, xạ khuẩn…để có kết quả cao hơn [30]. Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym cellulase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ CMCase của chúng theo phương pháp trong phần 2.2.3.1.

Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại ba chủng nấm sợi Tiến hành cấy ba chủng nấm trên các MT khác nhau theo phương pháp

Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym này của 10 chủng là thống nhất nhau. Chúng đều có nguồn gốc từ lớp đất mặt, nơi có nguồn thức ăn rất phong phú và nhiều cơ chất cảm ứng khả năng sinh enzym cellulase. Mặt phải màu xanh ngọc bích sau chuyển sang xanh xám, có rãnh nhăn nhúm, mặt trái màu nâu vàng sau chuyển sang nâu đen.

Sau đó, chúng tôi tiến hành định danh đến loài ba chủng nấm trên tại công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC, 45 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, Tp. Chủng Đ’0 Ascotricha guamensis Ames, 1986 Chủng Đ’3 Penicillium oxalicum Thom and Currie, 1905 Chủng Đ2b Aspergillus fumigatus Kenneth B- Raper and.

Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển và hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi

Đây là hợp chất giàu cellulose rất khó phân hủy, chỉ có những chủng nấm sợi nào có khả năng sinh enzym cellulase mới sử dụng được nguồn cacbon này để chuyển hóa thành glucose để hấp thụ.  Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm Thí nghiệm này nhằm mục đích xác định thời gian tối ưu để thu nhận enzym cellulase có hoạt lực cao nhất. Ta thấy thời gian sinh trưởng của các chủng nấm sợi chậm kéo theo thời gian sinh enzym cellulase cũng chậm hơn so với nấm sợi sống ở đất liền.

Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi sống ở RNM Cần Giờ, thời gian sinh trưởng rất chậm và khả năng sinh enzym cellulase cũng tỉ lệ thuận với tốc độ sinh trưởng của nấm sợi. Đây là MT có độ ẩm và hàm lượng cám thấp không đủ thành phần dinh dưỡng nên chưa thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzym cellulase của nấm sợi. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Các tác giả Toyama và Ogawa (1997) cũng nhận xét rằng các chủng nấm sợi khác nhau cần độ ẩm khác nhau cho quá trình phát triển của chúng.

Nếu tăng độ ẩm cao hơn sẽ làm cơ chất quá ẩm, độ xốp giảm và ngăn sự khuếch tán O2 từ bên ngoài vào MT, sự sinh trưởng của nấm sẽ chậm và khả năng sinh enzym sẽ giảm [30].

Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi

Sự kết hợp hoạt động của các enzym trên giúp phân giải mạnh các biopolymer, nguồn cơ chất phổ biến trong RNM Cần Giờ. Nhờ đó chúng sẽ phân hủy xác động vật biển như các loài giáp xác, vỏ tôm, cua…hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ. Chúng tôi cũng tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp như mục 2.2.2.6.

Qua kết quả trên ta thấyba chủng nấmđều có khả năng sinh kháng sinh tiêu diệt các VSV gây bệnh, nhưng mức độ đối kháng yếu. Như vậy, qua kết quả khảo sát ta thấy ba chủng nấm sợi đều có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh như cellulase, protease, amylase, kitinase, các chất kháng sinh chống lại các VSV gây bệnh như E.coli, B.

Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba chủng nấm sợi

Ở lô thí nghiệm nhiệt độ tăng cao hơn đối chứng do tác động của dịch chiết enzym phân cắt thành phần cellulose của rơm rạ, quá trình trao đổi chất tăng nhanh nên nhiệt độ cũng tăng cao hơn. Trong khi ở mẫu đối chứng mới bắt đầu phân cắt sợi rơm nên nhiệt độ vừa tăng cao hơn nhưng thấp hơn so với mẫu thí nghiệm (320C). Từ kết quả ở bảng 3.24 ta thấy rằng việc bổ sung VSV vào đống ủ có hiệu quả hơn ủ nhờ VSV tự nhiên có trong đống ủ, rút ngắn thời gian ủ, giảm ô nhiễm MT gây ra do thời gian ủ kéo dài.

Mẫu ủ không có bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi cũng phân hủy nhưng thời gian chậm hơn, phải kéo dài đến 65 ngày mới đạt được độ phân hủy giống như mẫu ủ có bổ sung dịch enzym. So với báo cáo của Lê Thị Thanh Thủy (2001) thì kết quả này thấp hơn, nhưng so với mức chuẩn để đánh giá độ chín của phân ủ là trọng lượng tươi 160g thì chủng A.