Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR và thử nghiệm ứng dụng

VẬT LIỆU

+ Thang DNA: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thang DNA chuẩn 100bp do Promega cung cấp ; kích thước các vạch của thang chuẩn như Hình 4. - Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA) dùng để phục hồi và giữ giống vi sinh vật thành phần gồm 1,5g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 15g agar nước cất vừa đủ 1 lít. Trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối cùng là 1 lít, chỉnh pH môi trường khoảng 7,4 và phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham.

+ Trypton water (nước trypton): dùng để thử nghiệm khả năng sinh Indol có thành phần gồm 20g tryptone hoặc trypticase, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3 ± 0,2. - Mẫu thực phẩm: mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các chợ (Tõn Phỳ, Thủ Đức, Bào Sen,ù Nancy, Trạm 2 Cầu Vượt và siờu thị ( Đầm Sen , Miền Đụng) trong tháng 8 năm 2004 thuộc khu vực thành phố Hồ Chí Minh. - Chủng vi sinh vật: các chủng vi sinh vật dùng trong luận văn được nhận từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.

HCM, bao goàm: Salmonella typhimurinum, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Staphylococus aureus, Shigella sonnei, Clostridium botulinum ,Clostridium perfringgens và các chủng E.

PHƯƠNG PHÁP

Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển vô trùng 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào giữa đĩa petri vô trùng; sử dụng mỗi đầu tip riêng cho một độ pha loãng và mỗi độ pha loãng thực hiện từ 2 – 4 đĩa. Cấy các khuẩn lạc vào các ống môi trường thử nghiệm sinh hoá sau đây: 1 ống canh trypton; 2 ống MR-VP; 1 ống Simon citrate để thực hiện thử nghiệm IMViC (indol, methyl red, VP và citrate). - Thử nghiệm Simon citrate: trong môi trường Simon citrate, phản ứng là dương tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang xanh da trời, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển màu.

Các mẫu không có sản phẩm khuếch đại hay có vạch sản phẩm khuếch đại không trùng với vạch khuếch đại của mẫu đối chứng dương hay không tương ứng với kích thước đã biết trên thang DNA chuẩn là những mẫu âm tính. Thực hiện phân tích lập lại 10 lần bằng phương pháp PCR trên cùng một dịch mẫu đã xử lý, tại cùng một thời điểm, trên cùng một điều kiện với mọi thành phần của phản ứng đều không thay đổi. - Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi: tiến hành khảo sát các phản ứng PCR ở những điều kiện nhiệt độ bắt cặp khác nhau trong khi vẫn giữ nguyên các thành phần phản ứng.

- Khảo sát giới hạn dao động nồng độ Taq DNA polymerase cho phép: trong qui trình đã được thiết lập, lượng Taq DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng là 0,5U/25àl.

PHÂN LẬP CHỦNG E. COLI TỪ MẪU THỰC PHẨM

Để xác định thời gian xử lý tốt nhất chúng tôi tiến hành khảo sát xử lý bằng nhiệt ở các thời gian khác nhau trong khoảng 10 – 40 phút. Kết quả điện di cho thấy từ giếng 2 đến giếng 6, phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại có độ dài bằng với sản phẩm chuẩn ở tất cả các trường hợp xử lý dịch tế bào bằng nhiệt pháp xử lý bằng nhiệt. Ở cỏc khoảng thời gian xử lý nhiệt khỏc nhau đều cho tớn hiệu đại rừ nột do vậy để tiết kiệm thời gian chúng tôi chọn thời gian xử lý để phá vỡ tế bào giải phóng khuôn DNA là 10 phút.

Các chủng vi sinh vật này được nhận từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, Đại học RMIT (Úc) và Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh. - Nồng độ Mg2+: ion Mg2+ có tác dụng tăng cường ái lực giữa mồi và khuôn DNA đồng thời giúp cho Taq DNA polymerase gắn dNTP vào mồi trong giai đoạn kéo dài. Ngược lại, nếu hàm lượng ion này quá thấp sẽ không cho hay cho quá ít sản phẩm khuếch đại, không thể phát hiện được khi điện di.

Tuy nhiên để đồng nhất với các qui trình phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng PCR chúng tôi chọn nồng độ Mg2+ là 2,5mM để thiết lập qui trình phát hiện E. Sau điện di gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút, rửa lại bằng nước rồi quan sát sản phẩm khuếch đại trên hộp đèn soi UV có bước sóng 312nm. Thời gian cho toàn bộ qui trình khoảng 24 giờ (bao gồm khoảng 20 giờ tăng sinh và 4 giờ thực hiện phản ứng PCR) tính từ lúc nhận mẫu cho đến lúc trả lời kết quả.

XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP 1. Giới hạn phát hiện

Mẫu bánh bông lan gây nhiễm lần 1 cho kết quả âm tính ở cả hai phương pháp nhưng lần 2 cho kết quả dương tính, có lẽ do lần 1 việc gây nhiễm không thành công. Tuy giới hạn phỏt hiện của 2 phương phỏp là tương đương nhau nhưng rừ ràng phương pháp PCR có hiệu quả hơn so với phương pháp nuôi cấy vì có thời gian phát hiện ngắn hơn, chỉ sau khoảng 24 giờ kể từ khi phân tích. Để đánh giá các thông số kĩ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy chúng tôi tiến hành chọn các mẫu đại diện cho các nhóm thực phẩm khác nhau.

- Khảo sát giới hạn dao động nồng độ mồi cho phép : Nồng độ mồi trong một phản ứng quyết định số lượng bản sao của DNA mục tiêu trong quá trình khuếch đại. Nồng độ mồi quá cao sẽ cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu, ngược lại nồng độ mồi quá thấp sẽ cho ít sản phẩm khuếch đại, khó phát hiện trong quá trình điện di, dễ gây nên kết quả âm tính giả. - Khảo sát giới hạn dao động cho phép của nồng độ Taq: Taq DNA polymerase là thành phần không thể thiếu của phản ứng khuếch đại nhưng được sử dụng với hàm lượng rất nhỏ nên sự sai số do dụng cụ kĩ năng thao tác là khó tránh khỏi.

Để đánh giá giới hạn sai số cho phép về nồng độ enzym này trong phản ứng chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ dao động trong khoảng 0,5 - 2,0l/ phản ứng.

ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN E. COLI TRÊN CÁC MẪU THỰC TẾ Mục đích của thí nghiệm này nhằm so sánh phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy

Kết quả điện di khảo sát giới hạn dao động cho phép của nồng độ Taq DNA polymerase. Các kết quả phân tích độ ổn định của phản ứng PCR để phát hiện E. Kết quả của phân tích trên 70 mẫu này chưa đủ để khẳng định tỉ lệ nhiễm E.

Đây chỉ là kết quả bước đầu giúp cho các nhà quản lý thực phẩm có sự đánh giá sơ bộ về tỉ lệ nhiễm vi sinh vật này trong thực phẩm hiện nay.