Ứng dụng chỉ thị RFLP phân tích DNA ở cây dứa

Chỉ thị RFLP (RFLP marker)

Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh năm 1980. - Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA (loại enzyme 6 cắt và 4 cắt). Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau.

- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên DNA genome. Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng lai cellulose hoặc nylon. Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ.

Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống lúa kháng, nhiễm bệnh đạo ôn (Nguyễn Trịnh Toàn và cs, 1997). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp này đòi hỏi số lượng và chất lượng DNA phải cao, tốn nhiều công sức, thời gian và đắt tiền (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).

Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR

Để primer được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra. - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv, 1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại. Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 720C trong 5 phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 40C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004).

Nếu có 50 % G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính đặc hiệu. Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991). Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide.

Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn. Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy cảm (Ramakrishna và ctv, 1995).

Nghiên cứu trên Thế Giới

Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di.

Vật liệu

• Dụng cụ và hóa chất

Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm.

- Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies) - Máy chụp hình gel bằng tia UV. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR - Máy thermal cycler (Biorad). - Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL.

Phương Pháp 1. Đánh giá kiểu hình

• Đánh giá kiểu gen 1. Tách chiết DNA

- Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục. - Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. - Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l).

Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt. Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l. Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide.

Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến. NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting). Các băng được nhập vào chương trình theo quy tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1.

Số liệu này sẽ được sử dụng để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv,. Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package-NTSYS để tiện dụng hơn.

Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1. Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1.