Tổng quan về các phương pháp di truyền trong nghiên cứu dịch tễ phân tử bệnh lao

Nguyên lý của phương pháp Spoligotyping

Cấu trúc của cụm DR trên nhiễm sắc thể M.tuberculosis H37Rv và M.bovis BCG P3 (các ô hình chữ nhật màu xanh biểu thị các trình tự lặp lại trực tiếp bao gồm 36 cặp bazơ -DR). Một trong những phương pháp sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử là Spoligotyping. Nguyễn Văn Quyết gen khác thường như chủng Bắc Kinh (Beijing) hoặc để điều tra quá trình tiến hóa về mặt di truyền của vi khuẩn lao khi kết hợp với các kỹ thuật khác [8].

Ngoài ra, do kỹ thuật Spoligotyping có thể thực hiện trực tiếp với bệnh phẩm soi kính dương tính nên còn cho phép phát hiện nhanh vi khuẩn lao từ bệnh phẩm. Khi so sánh cụm DR của nhiều chủng M.tuberculosis khác nhau người ta thấy thứ tự sắp xếp của các đoạn trung gian hầu như không thay đổi. Lợi dụng đặc điểm này người ta dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi có gắn biotin có trình tự bổ trợ cho trình tự DR để khuyếch đại về mặt số lượng toàn bộ các đoạn trung gian có trong genom của mỗi vi khuẩn (Hình 4).

Sản phẩm PCR là các đoạn trung gian được lai với 43 oligonucleotid đã biết trình tự được gắn sẵn trên màng nitrocelluler. Do các đoạn trung gian đã được đánh dấu bằng biotin, nên tác dụng với streptavinin có trong cộng hợp và bộc lộ màu dưới tác dụng của cơ chất phù hợp, giúp nhận biết được khi chụp phim âm bản (Hình 5). Kết quả lai ghép giữa các đoạn trung gian trong mỗi vi khuẩn sẽ tạo nên kiểu hình vạch Spoligotype đặc trưng cho chủng vi khuẩn đó (Hình 5).

Phương pháp nghiên cứu

- Gặt khuẩn lạc vi khuẩn lao phát triển trên môi trường Lowentein-Jensen vào ống nhựa eppendorf có dung lượng 2 ml chứa sẵn 150ml dung dịch TE (TrisHCl 10mM, EDTA 1mM). Hỗn dịch phản ứng sau khi được chia vào các ống chạy PCR cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (trong đá hoặc trong tủ lạnh ở 4ºC) cho đến khi chạy phản ứng, tốt nhất là dùng luôn trong ngày. Nhỏ vào mỗi ống phản ứng 02àl mẫu DNA của một chủng vi khuẩn lao. Ống chứng õm được cho 02 àl dung dịch TE và ống chứng dương được cho 02 àl DNA của chủng M.tuberculosis H37Rv chuẩn thức, ống chứng dương thứ hai cho 02 àl DNA của M.bovis chuẩn. Nguyễn Văn Quyết Chương trình chạy PCR: Chương trình chạy PCR khuyếch đại DNA đặc hiệu của chủng M.tuberculosis bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn khởi động sử dụng nhiệt độ 96ºC trong 3 phút nhằm tách hoàn toàn các đoạn DNA kép có trong ống phản ứng; tiếp theo đó là chu trình khuyếch đại DNA với 3 bước liên tục: 1) biến tính trong 1 phút, 2) gắn mồi trong 1 phút và 3) bước tổng hợp kép dài được thực hiện trong 30 giây (xem bảng dưới đây). Sản phẩm PCR được lai với 43 trình tự oligonucleotid khác nhau tương ứng với 43 đoạn trung gian (spacers) của vi khuẩn lao thuộc nhóm M.tuberculosis đã được gắn sẵn trên màng lai.

Do đoạn mồi Dra có gắn biotin ở đầu 5’, nên tất cả các sản phẩm PCR đều được gắn biotin ở đầu 5’, sau đó các đoạn này sẽ được phát hiện khi màng lai được chụp sang phim. Lần lượt làm đầy cỏc khe cũn lại với 150àl dung dịch cú chứa các sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn cần phân tích sao cho không để tạo bọt khí. Ủ màng lai ở 60ºC trong vòng 1 giờ, giữ cho minibloter nằm ngang trong suốt thời gian ủ, lắc nhẹ để không làm tràn dịch lỏng trong minibloter ra bên ngoài và tránh lây nhiễm dịch lỏng giữa các khe trong minibloter với nhau.

Ngâm màng trong dung dịch cộng hợp streptavidin-peroxidaza được pha loóng 1/4000 (3,5 àl cộng hợp streptavidin- peroxidaza trong 14ml 2xSSPE/0,5% SDS) và ủ trong lò lai ở 42ºC trong 90 phút (để peroxidaza không bị mất hoạt tính enzyme cần để nhiệt độ không cao hơn 42ºC). 19.Ủ màng lai trong 40ml dung dịch phát hiện E.C.L trong 2 phút dùng tay lắc nhẹ nhàng để tất cả các vị trí của màng lai đều tiếp xúc với dung dịch phát hiện E.C.L. Ghi nhận các tín hiệu lai trên phim chụp: Kết quả có thể ghi nhận bằng mắt thường sự xuất hiện hoặc không có các vệt đen trên phim âm bản tại các vị trí lai DNA/DNA hoặc sao chụp phim, nhập kết quả vào phần mềm phân tích spoligotyping để phân tích.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sau khi đưa kết quả phân tích spoligotyping của các chủng M.tuberculosis vào phần mềm của cơ sở dữ liệu Spoligotyping quốc tế spolDB4, kiểu hình spoligonucleotid của mỗi chủng được số hóa thành một số có 15 chữ số, đồng thời tên của kiểu hình tương ứng đã có trong cơ sở dữ liệu sẽ xuất hiện nếu kiểu hình này đã có sẵn trong ngân hàng cơ sở dữ liệu. Các chủng chưa có tên có nghĩa trong ngân hàng cơ sở dữ liệu chưa có kiểu hình tương ứng. Sau khi phân tích 65 chủng lao phân lập được từ bệnh nhân lao Hưng yên, chúng tôi thấy có tất cả 34 kiểu hình spoligonucleotid, trong đó 44 chủng M.tuberculosis thuộc 13 kiểu hình đã được xác định số hiệu (Bảng 3a), 21 chủng còn lại thuộc 21 kiểu hình chưa có tên trong ngân hàng dữ liệu spolDB4 (Bảng 3b).

Nguyễn Văn Quyết Chú thích: EAI5- chủng có nguồn gốc từ Đông Phi Ấn, EAI4_VNM- có nguồn gôc từ Đông Phi Ấn (VNM là mã chủng Việt Nam); MANU- gia đình các chủng lao Ấn Độ; T-gia đình các chủng lao hiện đại. Các kiểu hình còn lại đều gồm các chủng đơn được xác định thuộc nhóm H và MANU1 (Bảng 3a). Như vậy, số lượng các chủng chưa biết tên có tính đa dạng hơn so với các chủng đã biết trong ngân hàng số liệu.

BÀN LUẬN

Yếu tố IS thường chỉ mang thông tin di truyền liên quan đến tính di chuyển và điều hòa, trong đó, IS6110 có tính đặc trưng cho các chủng thuộc nhóm M.tuberculosis, vì vậy thường được sử dụng như dấu ấn di truyền trong phân loại chủng và nghiên cứu tính lây truyền của chủng trong cộng đồng thông qua các phương pháp như spoligotyping [5,14,16-18,22-25]. Dựa vào đặc điểm spoligotype có thể đưa ra các mô hình phân tử của quần thể vi khuẩn lao phân lập từ các khu vực nghiên cứu khác nhau cho phép xác định đặc điểm phân tử của quần thể từ đó đánh giá được mức độ quan trọng của từng kiểu mô hình nhằm tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học, khả năng kháng thuốc, mức độ lan truyền của từng kiểu mô hình, v.v. Phương pháp spoligotyping là phương pháp đơn giản, ít tốn kém lại rất hiệu quả trong việc phân tích số lượng chủng lao lớn của các nghiên cứu tiến hành trên quy mô rộng.

Phương pháp này có thể thực hiện với lượng DNA ít hơn nhiều so với các phương pháp khác và không cần DNA tinh khiết, có thể thực hiện trực tiếp trên bệnh phẩm, mảnh cắt sinh thiết hoặc phiến nhuộm Ziehl-Neelsen. Ngoài ra kết quả spoligotyping có thể chuyển sang dạng số hoá vì vậy cho phép việc lưu trữ, vận chuyển, gộp số liệu có thể thực hiện được một cách dễ dàng. Kết quả cho thấy chủng lao Bắc Kinh chiếm tỷ lệ cao nhất tới 33,8% cho thấy vai trò quan trọng của nhóm chủng này trong việc gây bệnh lao trong cộng đồng, đặc biệt đối với các cộng đồng được tiêm vacxin BCG với tỉ lệ cao như ở Việt nam.

Đây là chủng gây bệnh phổ biến trên toàn cầu (chiếm 13% tổng số chủng trong spolDB4), đặc biệt là khu vực Đông Á (chiếm khoảng 50% tổng số chủng tại khu vực này). Số lượng kiểu hình spoligotype của các chủng M.tuberculosis trong nghiên cứu này khá đa dạng, gồm 34 kiểu hình trong đó có 21 chủng chưa có tên trong ngân hàng dữ liệu spolDB4. Nhóm chủng EAI4_VNM cũng có nguồn gốc từ Đông Phi Ấn song hiện đang được coi là dòng vi khuẩn lao điển hình của Việt Nam (do vậy có mã hiệu EAI4-VNM, VNM là mã chủng Việt Nam) trong cơ sở dữ liệu quốc tế [14].