Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phụ phẩm chế biến mỡ cá

Nguyeõn lieọu

Mỡ cá - chiếm từ 15 - 20% trọng lượng – ban đầu được các cơ sở chế biến nấu thành mỡ nước cung ứng cho thị trường, sau đó được các doanh nghiệp nghiên cứu để sản xuất 2 loại dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụng trong công nghệ dược phẩm, thực phẩm; loại nặng sản xuất dầu biodiesel sử dụng cho động cơ. Từ phụ phẩm thô, Công ty CP ứng dụng công nghệ thích hợp (STECG J.S.C) làm ra bột cá đạt > 45o đạm, sản xuất ra mỡ sạch, và đã tiếp tục nghiên cứu làm ra các sản phẩm có giá trị cao hơn như dầu biodiesel (giá thành khoảng. 6.500đ/l) hoặc các chất nền dùng trong mỹ phẩm, và đang xem xét nghiên cứu chiết suất DHA từ mỡ cá để sử dụng trong chế biến thực phẩm và chăn nuôi ….

Enzyme hệ tiêu hóa

Thông thường, trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kết hợp vào enzyme do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phõn tử cơ chất trởứ nờn hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng. Enzyme từ cá được dùng trong sản suất cá, để giúp cho quá trình loại bỏ da, vảy, và màng mà khi dùng cách khác rất khó khăn trong việc loại bỏ, ví dụ như là da cá thu, cá đuối … Chúng còn được dùng trong sản xuất trứng cá, thủy phân cả bao tải trứng cá, cho phép loại bỏ hơn 50% so với chỉ sử dụng phương pháp truyền thống tách bằng trụ quay.

Các phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme [3]

Gần đây ứng dụng các phương pháp mới (điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel…) phối hợp với các biện pháp thường đđược dùng trước đây (biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ) cho phép thu được phẩm vật của nhiều enzyme với độ thuần khiết cao. Nguyên nhân chủ yếu do một mặt enzyme có trong tế bào với lượng rất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lý hoá rất giống nhau, hơn nữa enzyme lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúc tác do tác động của các yếu tố bên ngoài. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (enzyme) ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hoà) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhiều chất trên cột sephadex, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuyếch tán vào bên trong các sephadex đã đươc ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử chất có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ đươc chiết nhanh khỏi cột. Các enzyme này gồm có trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, cacboxyl-peptidase A và B, aminopeptidase, amylase, lactase, saccharase, lipase, ribonuclease, desoxyribonuclease … Tỷ lệ enzyme này trong dịch tụy không thay đổi ngoại trừ vài trường hợp thiếu hụt có chọn lọc của lipase và trypsinogen.

Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme

Tất cả sau đó được cho đồng thời vào tủ ấm trong một khoảng thời gian tùy ý, sau đó chúng được lấy ra, cho nước cất đến gần đầy và nhỏ 1 giọt iot 0,1 N cho mỗi ml dung dịch vào mỗi oỏng nghieọm. Hoạt tính amylase được xác định theo phương pháp Bernfield (1955), dựa vào sự giảm hàm lượng tinh bột và tăng hàm lượng dextrin được đo bằng axit 3, 5 dinitrosalisilic ở 540 nm. Một giọt dung dịch phenoltalein 0,1% được cho vào mỗi ml dịch thủy phân và toàn bộ được chuẩn đến khi xuất hiện màu hồng bằng dung dịch NaOH N/50 chứa 1 giọt dung dịch phenoltalein trong 1 ml.

Enzyme thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác. Ở những nước công nghiệp phát triển, các chất béo ăn được đã có mặt trong bữa ăn của con người, mà thành phần chủ yếu là triacylglycerols (TAGs) từ 100-150g mỗi ngày, chiếm khoảng 30% năng lượng mà cơ thể đưa vào hàng ngày. Các phương pháp dùng để xác định hoạt tính enzyme lipase gồm có phương pháp chuẩn độ, quang phổ, sắc ký, phóng xạ, sức căng bề mặt, đục kế, đo độ dẫn điện, hoá học miễn dịch, hiển vi….

Phương pháp đĩa Wilhelmy

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A. Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những người làm việc thuộc thế hệ sau ông: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hòa mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc. Sử dụng những enzyme đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của enzyme.

Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỷ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỷ lệ này thường là 1 cm-1, phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên lớp dicaprin tại 35mN.m-1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều lượng là 1000IU cho 1mg enzyme). Tuy nhiên, chúng ta phải lưu ý rằng những phân tử enzyme được liên kết bề mặt không chỉ bao gồm những enzyme đó (là những enzyme liên quan trực tiếp đến sự xúc tác) mà còn một lượng protein không đoán được (được hấp phụ lên lớp đơn).

Quang phổ học hồng ngoại

Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, cú thể theo dừi độ pH bằng việc quan sỏt sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar. Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester. Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase.

Với phương pháp pH-stat, hoạt động của lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFAs được giải phóng theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối không đổi. Trong trường hợp đặc biệt của lipase/colipase tụy tạng phức tạp, sự phân tích thường chung nhất là được thực hiện trong một máy điều nhiệt (ở 37oC) bình phản ứng hiện chứa đựng 0.5ml tributyrin trong 5ml dung dịch đệm có chứa nước (có pH. = 8), trong đó không có mặt của bất kỳ chất hoạt động bề mặt hay hệ nhũ tương nào khác. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những proton được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng.