Biểu hiện gen ngoại lai trong vi khuẩn E. coli sử dụng promoter tac
MỤC LỤC
Biểu hiện gen ngoại lai trong vi khuẩn
Promoter trp-lac còn gọi là promoter tac (một dạng promoter lai giữa promoter trp và promoter lac) đã được sử dụng thành công để sản xuất một lượng lớn protein trong E. Vector pAS1 là một plasmid dài khoảng 5,8 kb mang promoter PL của bacteriophage và vị trí cắt hạn chế duy nhất BamHI định vị ở codon khởi đầu ATG của gen cII của bacteriophage. Kiểm tra các khuẩn lạc riêng biệt mang đoạn DNA ngoại lai mong muốn bằng cách tách chiết DNA của vector plasmid, sau đó cắt bằng enzyme hạn chế thích hợp và điện di kiểm tra trên agarose gel.
Protein dung hợp có thể được tách chiết theo một số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside, điện di sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) hoặc phối hợp giữa các. Sự chèn vào của đoạn DNA ngoại lai (cDNA) trong các vị trí tạo dòng thích hợp cho phép sản xuất protein dung hợp của -galactosidase hoạt động với chuỗi peptide được mã hóa bởi DNA ngoại lai. - Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện điện di SDS-polyacrylamide gel.
Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hoặc bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích/chuyển thấm lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 9.11).
Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot. Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA (Hình 9.11).
Phương pháp phát hiện dòng vi khuẩn có DNA tái tổ hợp 1. Lai khuẩn lạc và vết tan
Những kháng thể tạo ra bằng cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng nguyên. Sự hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai. Ngoài ra, các vector còn chứa các gen chỉ thị bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng.
DNA được biến tính và cố định trên màng bằng đun nóng (baking) hoặc chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đã đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Theo hướng của phim (sau khi rửa) so sánh với đĩa agar gốc, sau đó sẽ có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang. PCR (polymerase chain reaction) cũng có thể được ứng dụng để sàng lọc các thư viện genomic DNA hoặc cDNA được xây dựng trong các plasmid vector hoặc bacteriophage vector.
Sàng lọc bằng PCR có thể được đảm bảo trong 3-4 giờ trong khi đó nó có thể mất một vài ngày trước khi phát hiện bằng kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization). Kỹ thuật sàng lọc bằng PCR thể hiện chỉ thị về kích thước của các đoạn chèn DNA được tạo dòng hơn là trình tự của đoạn chèn, tuy nhiên các primer PCR đặc trưng cho đoạn chèn DNA ngoại lai cũng có thể được sử dụng. Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi 4 loại deoxyribo.
3 Sự thoái biến (suy biến) của mã di truyền (degeneracy): Bình thường có thể có 64 tổ hợp bộ ba mã hóa khác nhau của 4 nucleotide trong khi đó chỉ có 20 amino acid phổ biến và một amino acid lại có thể có nhiều bộ ba mã hóa. Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của probe tối thiểu phải là 109 dpm/μg, mặc dù hoạt tính 108 dpm/μg có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.
Các ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp
Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không lớn. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn. khó đông máu), hoạt tố plasminogen mô (dùng để hòa tan các huyết khối trong bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim), interferon, interleukin, DNA vaccine…. Các chủng vi khuẩn mới hữu ích thu được từ kỹ thuật hiện đại này đang được phát triển để phân hủy các hóa chất độc và các chất gây ô nhiễm, tăng cường thu hồi dầu, tăng nitrogen cho cây trồng, và ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn và vi nấm gây bệnh. Cây bí (squash) biến đổi di truyền có tên là Freedom II, mang các gen của virus 2 gây bệnh khảm ở dưa hấu (watermelon mosaic virus 2) và virus gây bệnh khảm màu vàng ở cây zucchini (zucchini yellow mosaic virus) để chống sự nhiễm trùng virus.
Độc tố protein từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã giết một cách chọn lọc các ấu trùng của các sâu bọ côn trùng nhất định nhưng lại không gây độc cho sự sống của các động vật hoang dã, người và các loài côn trùng khác. Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta phải cần đến sự can thiệp của liệu pháp gen, một hướng chữa bệnh gắn liền với các kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại như các vi thao tác gen, sửa đổi thay thế gen. Có nhiều khái niệm khác nhau về liệu pháp gen, nhưng cách hiểu chung nhất là tập hợp các biện pháp để sử dụng các gen cần thiết (còn gọi là gen trị liệu) nhằm mục đích chữa bệnh cho con người.
- Gen trị liệu còn là các gen bất hoạt được đưa vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có tác dụng chống lại bệnh tật. Bằng kỹ thuật chọc ối, kết hợp đồng thời phân tích máu bố mẹ bằng enzyme hạn chế, người ta có thể chẩn đoán sớm trước khi sinh (vì enzyme hạn chế có khả năng phân biệt được gen đột biến với gen bình thường). Thứ nhất, có thể rút ngắn được thời gian nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR, chẳng hạn chẩn đoán bệnh HIV-1, dùng phương pháp PCR chỉ mất một ngày so với 3-4 tuần nuôi cấy của phương pháp truyền thống.
Thứ ba, việc tạo dòng một gen dùng làm probe đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một probe người ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác nhân gây bệnh, điều mà chỉ một kháng thể không thể làm được. Cuối cùng, nếu trước kia phải cần đến nhiều kỹ thuật (quan sát dưới kính hiển vi, nuôi cấy trên một loạt môi trường, miễn dịch học..) thì hướng chẩn đoán bằng sinh học phân tử chỉ cần một kỹ thuật (lai phân tử hoặc PCR). Đối với các tác nhân vi khuẩn, đã có nhiều bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử được thương mại hóa như: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pneumoniae, Salmonella, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae.