Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A, enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nước bên. Receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4 cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thường của ruột, cơ chế tác động của receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các enzyme nội bào. STb ban đầu cũng được tổng hợp dưới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó đƣợc chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng lượng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb không tương đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein, STb làm tổn thương các tế bào ruột do tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chƣa đƣợc xác định có thể độc tố này gắn vào những vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trước khi được đưa vào trong, tác động của STb trong tế bào không giống nhƣ STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonat, STb không làm gia tăng hàm lƣợng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lƣợng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS).

Để có thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn đƣợc vào thành tế bào biểu mô ruột, khả năng gắn đƣợc vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột đƣợc thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae có cấu tạo nhỏ và chiếm một số lƣợng lớn hơn tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae có nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau, mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, bộ gene có 4 Mbp (23), trọng lƣợng của bộ genome khoảng 2,4ì109 đến 2,6ì109 dalton đặc biệt trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại kháng sinh nhƣ gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh đƣợc qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật đường ruột. Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton.

Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết subtilin ra ngoài môi trường bên ngoài (26). Sự tổng hợp của subtilosin đƣợc kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở pha tăng trưởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dưỡng trong môi trường và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo bào tử, SpoA đƣợc phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy sự biểu hiện của operon sbo-alb. Trong cấu tạo của AlbB có hai nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này đƣợc xem là trung tâm S- Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tương tự như là peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này đƣợc thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre- subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24).

Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin đƣợc tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trường, trong cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tương tự như antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử. SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP (21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin, bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Sau khi đƣợc tổng hợp dạng tiền chất của TasA đƣợc chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dương liên kết với màng tế bào chất, sau đó đoạn peptide kỵ nước sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục đƣợc cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36).

Operon mã hóa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Tyr và D-allo-Thr, fenE mó húa cho enzyme hoạt húa cho L-Glu ã D-Ala (D-Val), fenA mó hóa cho enzyme hoạt hóa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hóa cho enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo.

CỨU