Nghiên cứu đặc điểm sinh học, nhân giống và hàm lượng huperzine A của loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học và tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng.

Ý nghĩa thực tiễn

Thành công trong phương pháp nhân giống sẽ góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa tại các vùng có khả năng trồng ở Việt Nam, cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ.

Nhân giống Thạch tùng răng cưa

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ra ngôi cây con: ra ngôi 4 tháng sau giâm; ra ngôi 5 tháng sau giâm; ra ngôi 6 tháng sau giâm; ra ngôi 7 tháng sau giâm, ra ngôi 8 tháng sau giâm hom thân đến tỉ lệ cây con héo, chết và tỷ lệ cây con hồi xanh. Các chồi in vitro có chiều dài từ 2 - 3 cm thu được từ các thí nghiệm trên, được tách riêng lẻ và cấy lên môi trường thích hợp có bổ sung riêng lẻ NAA, IBA với nồng độ từ 0,1- 1,5 mg/l để theo dừi khả năng hỡnh thành và phỏt triển rễ của chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy.

Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa 1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa

Nhận định trên dựa trên một số căn cứ như sau: thứ nhất, bào tử của loài Thạch tùng răng cưa phát triển rất chậm, kể từ khi bào tử nảy mầm phát triển qua giai đoạn giao tử thể, cuối cùng đạt được đến giai đoạn bào tử thể trưởng thành phải mất ít nhất 15 năm nên trong tự nhiên khả năng tái sinh của bào tử để tạo thành cây con cần thời gian tương đối dài [32]. Khảo sát thực tế tại các khu vực nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy sự phân bố của Thạch tùng răng cưa chỉ tập trung ở một số khu vực gồm 5 địa điểm tại Lào Cai (Nậm Cang, Sa Pa; Bản Hồ, Sa Pa; Tả Van, Sa Pa; Lao Chải, Sa Pa và Tả Phìn, Sa Pa) và 3 địa điểm tại Lâm Đồng (Bidoup - Núi Bà, Lạc Dương; Lạc Xuân, Đơn Dương và Nam Ban, Lâm Hà). Kết quả phân tích bước đầu cho thấy, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các cặp mẫu thu ở 5 địa điểm nghiên cứu thuộc cùng tỉnh Lào Cai hoặc 3 địa điểm nghiên cứu trong cùng tỉnh Lâm Đồng là gần tương đương nhau (dao động từ khoảng 0,06 đến trên dưới 0,20), cho thấy chúng có mối quan hệ di truyền rất gần, thậm chí có thể cùng chung một xuất xứ.

Chính vì vậy, sau khi tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đánh giá sự đa dạng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa nhằm xác định đúng cây dược liệu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xác định hoạt chất và hàm lượng HupA bằng kỹ thuật TLC và HPLC để xác định sự có mặt của HupA trong các mẫu nghiên cứu, đồng thời tìm ra mẫu cây có chứa hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết luận trong nghiên cứu của Ma và cộng sự (2005) là loài Thạch tùng răng cưa mọc ở rừng ẩm ướt cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với phát triển trong môi trường cú độ ẩm thấp; đồng thời, hàm lượng HupA thay đổi rừ rệt ở cỏc thời điểm khác nhau trong năm, giảm dần khi bắt đầu vào mùa đông và tăng dần vào mùa hè, với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [59, 138]. Như vậy, kết quả xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thay đổi theo mùa, mùa thu (ở Lào Cai, tương ứng với mùa mưa ở Lâm Đồng) cho hàm lượng HupA cao hơn so với mùa xuân (ở Lào Cai, tương ứng với mùa khô ở Lâm Đồng); đồng thời, sự tích luỹ HupA ở các mô lá cao hơn so với thân và rễ.

Nhân giống Thạch tùng răng cưa

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Long và cộng sự (2014) trong nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thực hiện tại trang trại rừng của vùng Yantuozhai, Gaowangjie, huyện Guzhang, địa khu Xiangxi, tỉnh Hồ Nam, Trung Quốc, nhóm tác giả đã đưa ra kết luận sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm cho hiệu quả nhân giống tốt nhất [117]. Kết quả này cho thấy một điểm khác trong việc sử dụng giá thể giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa so với nghiên cứu của Trung Quốc, cụ thể, nghiên cứu của Bao và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng giá thể thích hợp nhất cho việc giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là giá thể rong rêu với tỉ lệ hom giâm sống sót lên tới 90%. Kết quả này phù hợp với công bố của Qin và cộng sự (2010) khi nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân, các tác giả đã xử lý hom thân của loài Thạch tùng răng cưa bằng chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm trong thời gian 30 phút và nhận được tỉ lệ hom thân sống sót và ra rễ lên đến 98% [116].

So sánh ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IAA và IBA Sau khi khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IAA và IBA đến sự sinh trưởng của hom thân Thạch tùng răng cưa ở cả hai địa điểm nghiên cứu là Lâm Đồng và Lào Cai, nghiên cứu đã xác định được nồng độ và thời gian xử lý tốt nhất của từng chất điều hòa sinh trưởng. Để bảo tồn và phát triển nguồn gen Thạch tùng răng cưa ở nước ta, cần xây dựng mô hình nhân giống ở cả hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai, tuy nhiên, các điều kiện nhân giống thuận lợi hơn tại Lâm Đồng là một trong những điểm đáng lưu ý đối với việc lựa chọn địa điểm quy hoạch và xây dựng mô hình nhân giống Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu sự sinh trưởng của cây con bầu ươm sau giâm hom 4 tháng đến 8 tháng cho thấy chiều cao và đường kính thân của cây con Thạch tùng răng cưa sinh trưởng rất chậm, sau 8 tháng giâm hom thân, cây con đạt giá trị cao nhất là 6,80 cm, với chiều cao trung bình là 5,39 cm; như vậy, so với chiều cao lúc bắt đầu giâm (2,50 cm) thì sau 8 tháng chiều cao cây con tăng trung bình 2,89 cm tính từ mặt bầu ươm.

Kiểm tra cây con trước khi xuất vườn

Ảnh hưởng của các môi trường khoáng đến nuôi cấy Thạch tùng răng cưa Chồi Thạch tùng răng cưa in vitro được đem thử nghiệm trên 6 môi trường nuôi cấy khác nhau gồm: MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, WPM, B5 có bổ sung 20 g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,7- 5,8, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nhằm xác định môi trường khoáng cơ bản thích hợp với sự sinh trưởng, phát triển đối với cây Thạch tùng răng cưa. Khi bổ sung riêng lẻ chất điều hòa sinh trưởng BA hoặc kinetin ở nồng độ 0,1 mg/l thì các chỉ tiêu phát triển của chồi tăng hơn so với đối chứng nhưng không nhiều, tiếp tục tăng nồng độ BA hoặc kinetin lên 0,5 mg/l thì các chỉ tiêu phát triển của chồi tăng lên vượt trội, đặc biệt là đối với chất điều hoà sinh trưởng BA với số mẫu tạo cụm chồi đạt 75,67 và số chồi/ mẫu đạt 5,65 chồi, chiều cao chồi 1,60 cm, lá có màu xanh đậm, thân vươn cao. Sau khi đã xác định được nồng độ BA 0,5 mg/l và kinetin 1 mg/l là thích hợp cho tạo chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả tác động của hai chất điều hòa sinh trưởng trên đến khả năng tạo cụm chồi của mẫu cấy nhằm tìm ra chất điều hòa sinh trưởng thích hợp nhất đối với nhân chồi Thạch tùng răng cưa.

Trong thí nghiệm này, để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tạo rễ, chồi Thạch tùng răng cưa có kích thước hơn 2 cm được tách và nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS có bổ sung IBA, NAA riêng lẻ với các nồng độ: 0; 0,1; 0,5; 1 và 1,5 mg/l nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo với 4 công thức thí nghiệm theo như nghiên cứu của Zhou và cộng sự, đồng thời tiến hành thêm các thí nghiệm với môi trường 1/4 MS (môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh đã được trình bày ở trên) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và vitamin như công thức thí nghiệm của Zhou và cộng sự. Khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ chồi đỉnh của loài Thạch tùng răng cưa đã được nghiên cứu thành công: (1) Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi trực tiếp từ chồi đỉnh là mụi trường ẳ MS; (2) Mụi trường nhõn nhanh chồi là mụi trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l kinetin; (3) Chồi được tạo rễ trên môi trường 1/4 MS có bổ sung 1mg/l IBA.