Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin
MỤC LỤC
KẾT QUẢNGHIÊN CỨU 3.1. KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN
Kết quả nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid
Kết quả được thể hiện trong phụ lục 1.2 cho thấy, tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic của Si-A và Si-B trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện pic tương ứng trên SKĐ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện pic tương ứng trên các mẫu trắng. Kết quả ở hỡnh 3.3 cho thấy: Khi sử dụng các hệ dung môi pha động là (1) thì cho pic cân đối, sắc nét, chân pic hẹp và thời gian xuất hiện pic khoảng 9,2 phút nhưng phía trước có pic tạp lớn, nếu tiêm nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng rửa giải của hoạt chất. Kết quả ở hình 3.4 cho thấy: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic của chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện pic tương ứng trên sắc ký đồ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện pic tương ứng trên các mẫu trắng.
* Từ các kết quả đánh giá ở trên có thể thấy không xảy ra sự tương tác hóa học hay sự tương kị giữa silybin hoặc PC với hỗn hợp dung môi phản ứng ở khoảng nhiệt độ từ nhiệt độ phòng thí nghiệm đến 70°C trong 24 giờ.
Kết quả nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phòng thí nghiệm 1. Kết quả xây dựng phương pháp xác định hiệu suất phytosome hóa
Dạng phytosome silybin (hydrat hóa) được bào chế như dạng phức hợp (cân 0,5g silybin và 1,5g PC hòa tan trong 100ml hỗn hợp dung môi EtOHtd:THF (97:3)) đến khi kết thúc phản ứng thì cô bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được màng film mỏng. Ngoài ra, luận án ưu tiên lựa chọn PL tinh khiết hơn nhằm mục đích đánh giá được tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bào chế cũng như chứng minh được sự hình thành liên kết trong phytosome silybin. Kết quả ở hình 3.12 cho thấy trong môi trường pH 1,2 lượng silybin hòa tan của dạng phytosome (phức hợp sau khi hydrat hóa) cao hơn so với dạng phức hợp, đã đạt gấp sau 10 phút hòa tan, tuy nhiên phần trăm silybin hòa tan của dạng phytosome trong môi trường này cũng chỉ đạt gấp đôi so với dạng phức hợp sau 240 phút hòa tan.
Kết quả ở hình 3.16 độ hòa tan của silybin ở mẫu bột phytosome bào chế bằng phương pháp phun sấy cao hơn hẳn so với mẫu làm khô bằng bốc hơi dung môi và sấy thông thường, đặc biệt là trong môi trường đệm phosphat pH 6,8.
Kết quả bào chế, đánh giá một số đặc tính và chỉ tiêu chất lượng của phytosome silybin ở quy mô 150g/mẻ
Nhận xét: khi thay đổi một số thông số kỹ thuật trong quá trình bào chế phytosome ở quy mô 150g/mẻ, mẫu thu được không có sự khác biệt về các chỉ tiêu về độ ẩm, KLR, CI, hàm lượng silybin toàn phần, hàm lượng silybin dạng phytosome, hiệu suất thu hồi hoạt chất (Hth). Nhận xét: ở quy mô bào chế 150g/mẻ, bột phytosome silybin thu được vẫn đảm bảo về các chỉ tiêu chất lượng về độ ẩm (dưới 5%), hàm lượng silybin toàn phần (khoảng 13%) và hàm lượng silybin dạng phytosome (khoảng 12%). Kết quả đánh giá sự hình thành liên kết giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome Tiến hành đo và phân tích phổ FTIR, XRD, DSC, NMR theo như mô tả ở mục 2.2.1.3.i, của các mẫu gồm: Silybin nguyên liệu, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp vật lý Si-PC.
Nhận xét: Đường cong DSC của 4 mẫu silybin, PC, hỗn hợp vật lý và phức hợp Si-PC cho thấy mẫu silybin có một đỉnh thu nhiệt ở 172,3oC tương ứng với khoảng nhiệt độ nóng chảy của silybin.
Theo dừi độ ổn định của phytosome silybin
Tiến hành đánh giá chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.1.3.e. Sau thời gian bảo quản ở điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc, kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cả 3 mẻ vẫn nằm trong giới hạn cho phép. Tiến hành đánh giá hàm lượng silybin toàn phần và dạng phytosome theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.1.a.
Độ hòa tan trong dung dịch pH 6,8 của bột phytosome silybin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc (n=3).
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN
Theo dừi thấy ở mức liều này của phytosome silybin thỡ chuột cống trắng không bị chết, không xuất hiện triệu chứng bất thường nào trong 4 giờ sau uống thuốc thử, định kỳ trong 24 giờ và 72 giờ (lông mượt, da hồng không tím, không nôn, co giật, kích động, bài tiết…) và trong suốt 14 ngày tiếp sau đó. Kết quả từ phụ lục 9.5 đến 9.11 cho thấy các chỉ số gồm: Số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, Hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu (tỷ lệ. % bạch cầu lympho, bạch cầu trung tính và bạch cầu mono), số lượng tiểu cầu ở lô trị 1 và lô trị 2 không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so sánh giữa hai thời điểm trước và sau khi uống thuốc thử (p > 0,05). Quan sát bằng mắt thường và dưới kính lúp có độ phóng đại 25 lần trên tất cả các chuột thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của gan và thận. * Hình thái vi thể của gan và thận:. Quan sát hình thái vi thể của gan và thận của chuột sau 28 ngày uống thuốc trên kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy).
* Kết luận: Phytosome silybin khi dùng đường uống trong 4 tuần liên tục với 2 mức liều 28 mg/kg/ngày (tương đương liều điều trị dự kiến trên người) và 84 mg/kg/ngày (gấp 3 lần liều tương đương liều điều trị dự kiến trên người) không ảnh hưởng đến tình trạng chung, thể trọng, chức năng của hệ tạo máu, mức độ hủy hoại tế bào gan, chức năng gan, thận và cấu trúc vi thể gan, thận chuột cống.
BÀN LUẬN
VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 1. Về nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid
Do vậy, trong nội dung của luận án tiến hành khảo sát hai loại phospholipid là PC50% và PC90% nhận thấy phytosome bào chế với PC90% thể hiện tính ổn định vật lý hơn về các chỉ tiêu độ tan trong nước và tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa sau 1 tháng bảo quản ở điều kiện thường và điều kiện lão hóa cấp tốc (bảng 3.12). Tuy nhiên, đối với phytosome silybin trong nghiên cứu của luận án, với tỷ lệ mol Si:PC là 1:2 (lượng PC nhiều) đã là yếu tố góp phần giúp cho việc làm giảm KTTP được thuận lợi trong giai đoạn hydrat hóa, đồng thời với việc các đuôi hydrocarbon bao quanh lấy phần hoạt chất liên kết với PL trong giai đoạn này cũng sẽ góp phần ổn định cho phytosome [13]. Qua tham khảo một số tài liệu, đồng thời tiến hành đo nhiệt vi sai của Maltodextrin nhận thấy MD là chất mang có điểm chảy cao phù hợp làm tá dược trong điều kiện phun sấy ở nhiệt độ cao, giảm sự bám dính của hoạt chất trong buồng phun, cũng như giúp làm tăng khối lượng riêng của khối bột [152], [153].
Do đó, luận án tập trung nghiên cứu đánh giá độ ổn định của bột phytosome silybin phun sấy dưới tác động của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ ẩm) cũng như các yếu tố thuộc về chế phẩm thuốc (tính chất hóa lý của dược chất và tá dược, dạng bào chế, thành phần, quy trình bào chế, mức độ kín và bản chất của bao bì trong đóng gói trực tiếp).
VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN
Bên cạnh đó, vị trí lấy mẫu máu trên chuột cống thường có những nhược điểm như: ở vị trí tĩnh mạch đuụi thỡ lượng mỏu ớt (nhỏ hơn 250àL) khụng đủ để xử lý mẫu và khụng thể lấy nhiều lần trên một cá thể, ở vị trí hốc mắt tuy có thể lấy mẫu qua ống vi mao quản đặt vào phía dưới và trong mắt nhưng khi mắt bị tổn thương nếu tiếp tục lấy máu lần tiếp theo để định lượng nồng độ dược chất trong huyết tương thường kết quả không còn chính xác [12]. Các điểm lấy mẫu ở pha thải trừ thường là 4 điểm sau giá trị đỉnh, tuy nhiên các điểm lấy mẫu ở cuối pha thải trừ thường cách xa nhau nên giá trị t1/2 có sự chênh lệch lớn giữa các nghiên cứu (khoảng 3 giờ hoặc 15 giờ), điều này có thể dẫn đến chưa phản ánh hết được sinh khả dụng của phytosome silybin trong mô hình nghiên cứu [9], [12], [8]. Qua tham khảo hướng dẫn đánh giá sinh khả dụng của thuốc trong DĐVN V để đảm bảo độ tin cậy của số liệu đánh giá sinh khả dụng thì số điểm lấy mẫu không ít hơn 12 điểm và thời gian lấy mẫu nên kéo dài tới khoảng 3 đến 5 lần thời gian bán thải của dược chất hoặc khi nồng độ dược chất trong mẫu máu bằng khoảng 1/10 đến 1/20 giá trị nồng độ đỉnh [133].
Nhóm sử dụng phytosome silybin 30 mg/kg khối lượng cơ thể (tương đương khoảng 3,9 mg silybin/kg) thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan tương đương với nhóm sử dụng silybin nguyên liệu 30mg/kg khối lượng cơ thể (tương đương khoảng 28,8 mg silybin/kg), điều này cho thấy dạng phytosome đã giúp cải thiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan của silybin trên thực nghiệm.
ĐểNG GểP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án có một số đóng góp mới như sau
Kết quả nghiờn cứu cho thấy sau khi hỡnh thành dạng phytosome, silybin đó thể hiện rừ khả năng bảo vệ tế bào gan trên động vật thí nghiệm ngay ở mức liều 10mg/kg khối lượng cơ thể chuột (tương đương khoảng 1,3 mg silybin/kg). Nguyên nhân có thể do phytosome silybin đã được hấp thu nhanh hơn và đào thải lâu hơn so với silybin, ngoài ra hoạt chất được bảo vệ nên hạn chế sự phân hủy silybin trong cơ thể. Kết quả giải phẫu bệnh trong luận án có tỉ lệ khá tương đồng với các thí nghiệm gây độc bằng paracetamol gây độc trên chuột cống ở nhóm chứng (lô 1), nhóm mô hình (lô 2) với nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của quả dứa dại và cây môn nước trên mô hình gây độc bằng PAR [178], [172].
Quan sát mô bệnh học (bảng 3.42) cho thấy kết quả tương ứng với sự biến đổi enzym gan. Uống silymarin, silybin, phytosome silybin đó làm hạn chế rừ rệt mức độ tổn thương gan do PAR liều cao gây ra cả trên hình ảnh đại thể và vi thể. ĐểNG GểP MỚI CỦA LUẬN ÁN. phức hợp, hydrat hóa và phun sấy tạo bột khô).