Đa dạng di truyền, đặc điểm sinh lý, hóa sinh và nhân giống in vitro một số giống sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) trồng tại Thừa Thiên Huế

Mụctiêucụthể

-Đánh giá được thực trạng sản xuất cây sen và xây dựng sơ đồ phân bố củacácmẫugiốngsentrồng ởThừaThiênHuế. - Đánh giá được đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các mẫu giống sentrồng ở Thừa Thiên Huế nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc xác định các giốngsenhiệncó. - Cung cấp được các cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh lý (đặc điểm sinh trưởng,pháttriển,năngsuất)vàhóasinhcủamộtsốgiốngsenchínhở ThừaThiênHuế.

Phạmvinghiêncứu

Điều tra tình hình sản xuất và tiêu thụ cây sen, xây dựng sơ đồ phân bố vàđánh giá đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các mẫu giống sen trồng ở ThừaThiên Huế. Nghiêncứuđặcđiểmthựcvậthọc,sinhlý,hóasinhvàxácđịnhcácgiốngsenđịaphươngtriển vọng.Từđó,nghiêncứunhângiốnginvitromộtsốgiốngsenđượcchọn lọc nhằm cung cấp cơ sở cho việc bảo tồn nguồn gen cây sen ở Thừa ThiênHuế.

TỔNGQUANCHUNGVỀCÂY SEN 1. Nguồngốccâysen

Trong những năm gần đây các tác giả Nguyen (2001b) [73], Gou (2009, 2010) [37], [38], [39] đã đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các tính trạng hình thái nônghọcvàtươngquanditruyềncủacâysen.Kếtquảchothấygiữacácnhómsenlấycủ,lấyhoavàlấy hạtcósựkhácbiệtvềmộtsốtínhtrạngđặctrưng.Đồngthời,cũngdựavào sự khác biệt về đặc điểm nông sinh học,. Nghiên cứu mức độ mức độđa dạng di truyền kiểu gen của các giống sen ở các vị trí địa lý với các kiểu sinh tháikhácnhauđãđượctiếnhànhbởiMekbibvàcs(2020).Cáctácgiảđãsửdụngchỉthị SSR để đánh giá sự đa dạng của 15 quần thể sen nhiệt đới được thu mẫu từ TháiLan, Ấn độ và Úc. Kết quả chỉ ra những quần thể này thể hiện sự biến đổi di truyềnkhác nhau dựa trên điều kiện địa lý. Có thể khẳng định rằng các quần thể được tìmthấy ở mỗi quốc gia là duy nhất. các tác giả cũng đề xuất các biện pháp. nuciferaGaertn.) ở đồng bằng Sông Hồng. Ở Việt Nam, ngoài các tài liệu cổ và kinh nghiệm dân gian ghi chép được vềcác bài thuốc hay từ sen, ngày nay các công trình nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi [ 11],Phạm Hoàng Hộ [7], Vừ Văn Chi [2]… xỏc định được một số thành phần húa họctrong cõy sen và các tác giả này cũng khẳng định khả năng chữa bệnh của các bộphậnnhư:tim,lá,hạt,gương…củacâysen.

Nghiên cứu này là một bước tiến quantrọng trong việc xử lí các chất thải độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như đờisống của con người.Năm 2019, Painuly vàcsđã chỉ ra hiệu quảc ủ a b ộ t c ủ s e n trong việc hấp thụ Arsenic (As) ra khỏi dung dịch nước ở những vùng nông thônnghèovềkinhtế- xãhộitạiẤnĐộ.Kếtquảnghiêncứunàykhẳngđịnhcóthểsử.

KỸTHUẬTTRỒNGVÀ CHĂMSểCCÂYSEN 1. Giống

Nhângiốnginvitro(invitropropagation)còngọilàvinhângiống(micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấymô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật cókích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trongcác loại bình nuôi cấy khác. - Tạo giống mới: sử dụng các kỹ thuật để tạo ra các giống mới hoặc làm cácgiốngbấtthụtrởnênhữuthụ.Vídụnuôicấybaophấnvàhạtphấnđểtạonhững cây đơn bội từ bao phấn hoặc hạt phấn, sau đó lưỡng bội hóa và tạo thành đồng hợptử; nuôi cấy phôiin vitrogiúp khắc phục hiện tượng lai xa; kỹ thuật dung nạp tế bàotrần (protoplast) đã tạo được cây lai từ hai giống khác nhau khá xa về mặt di truyền;đặc biệt tạo giống cây trồngmới bằng kĩ thuật chuyểngen. BA,sau4tuầnnuôicấymẫutáisinhchồivàcụmchồitốtnhấtvới21,33chồivàchotỷ lệ tạo rễ 100% với môi trường MS có bố sung 0,54 μgM NAA và 30 g/L sucrose.Cây conđượcđưaratrồngthíchnghivàochậuvớiđấtđượcbổs u n g 2 g / L KMnO4, sau đó cây phát triển và cho ra lá tốt hơn ở bên trong nhà kính, với tỉ lệsốngsótđạt97,33%[111].

Tại Việt Nam, nghiên cứu về nhân giống cây sen (N. nuciferaGaertn.) bằngphương pháp nuôi cấy mô lần đầu tiên được thực hiện bởi Phạm Văn Lộc và cs(2017).Cáctácgiảđãkhảosátảnhhưởngcủamộtsốyếutốđếnsựtăngsinhchồivàtạorễinvitrocây sen(N.nuciferaGaertn.).Kếtquảchothấy,môitrườnghailớpvớitỷ lệ rắn: lỏng theo thể tích 1:2, trong đó thành phần môi trường lỏng MS bổ sungNAA 1,5 mg/L kết hợp với BA 0,5 mg/L, saccharose 30 g/L, thành. trườngrắnẵMSbổsungNAA1,5mg/L,BA0,5mg/L,saccharose30g/L,agar8,5g/Lgiỳpchồi tăng sinh tốt. Tuy nhiờn, tỏc giả chỉ dừng lại ở nghiờn cứu nhân nhanh chồi và tạo rễin vitrocây sen, việc nghiên cứu về quá trình huấn luyện thích nghi và đem cây con hoànchỉnhratrồngtrongnhàkínhhayngoàitựnhiênvẫnchưađượctiếnhành. Việc nhân giống cây sen tại Thừa Thiên Huế từ trước đến nay chủ yếu là từngó và củ sen. Phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại cảnh nhưthời tiết, chất lượng nguồn nước và phương pháp bảo quản giống. Đồng thời, nhân giống bằng kỹ thuật nuôicấy mô tế bào sẽ có nhiều ưu điểm như hệ số nhân giống cao, cây giống đồng đều,sứcsinhtrưởngcaovàsạch bệnh[111]. giá để làm cơ sở cho. CHƯƠNG2.VẬTLIỆU,NỘIDUNGVÀPHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 2.1. - Nguồn vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật học, sinh lývà hóa sinh là 6 giống sen được lựa chọn từ 66 mẫu giống sen bao gồm: 5 giống senđịa phương: Sen Hồng Phú Mộng, Sen Hồng Gia. VinhThanh),SenTrắngTrẹtLừm,SenTrắngTrẹtLồivà1giốngsennhậpcúnguồngốctừĐồngThỏplà SenCaoSản.

NỘIDUNGNGHIÊNCỨU

CHƯƠNG2.VẬTLIỆU,NỘIDUNGVÀPHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 2.1. - Nguồn vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật học, sinh lývà hóa sinh là 6 giống sen được lựa chọn từ 66 mẫu giống sen bao gồm: 5 giống senđịa phương: Sen Hồng Phú Mộng, Sen Hồng Gia. VinhThanh),SenTrắngTrẹtLừm,SenTrắngTrẹtLồivà1giốngsennhậpcúnguồngốctừĐồngThỏplà SenCaoSản. - Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu nhân giốngin vitrolà hạt sen tươikhoảng23-25ngàytuổicủahaigiốngSenTrắngTrẹtLừmvàSenĐỏỢt(Hỡnh2.1).

PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

- Tiêu chí điều tra: số hộ trồng sen, tên các giống sen hiện đang được trồng,nguồn gốc các giống sen, diện tích trồng sen, biện pháp kỹ thuật chăm sóc cây sen,các loại sản phẩm được khai thác từ cây sen, giá thị trường từng loại sản phẩm đượctiêuthụ. Dựavàokếtquảđiềutra,hìnhtháicơbảnđặctrưngcủagiốngvàkếtquảphântích đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái chúng tôi xác định được 6 giống sen(giống cây trồng) đang được trồng ở Thừa Thiên Huế: Sen Cao Sản, Sen Hồng PhỳMộng, Sen Đỏ Ợt, Sen Trắng Trẹt Lừm, Sen Trắng Trẹt Lồi, Sen Hồng Gia Long.Trên cơ sở sơ đồ phân bố các mẫu giống sen, chúng tôi thu thập 6 giống sen trên đểtiếnhànhthínghiệmđánhgiácácchỉtiêutiếptheo. [ 26].Mẫuđư ợcc ắt mỏ ng bằn gd ao lam, nh uộ m képv à là mtiêubản tạm thời theo thứ tự các bước sau: Ngâm mẫu cắt vào dung dịch Javen trong15-20 phút để tẩy sạch nội chất của tế bào, rửa sạch bằng nước cất (rửa ít nhất 3-5lần).

Để bình định mức trong bóng tối khoảng 10 phút cholượng ascorbic acid trong nguyên liệu được hòa tan hoàn toàn, lọc lấy dịch trong.Lấy 10 mL dịch lọc cho vào bình nón, thêm vào đó 10 giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ.Dùng dung dịch I2chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu xanh lam thì kết thúc quátrìnhchuẩnđộ. Cho vào mỗiống nghiệm 0,2 mL dung dịch thymol blue 0,03% trong ethanol 95% và lắc đều(ethanol 95% để cản trở sự vón cục của bột ở nhiệt độ hóa hồ, còn thymol blue tạomàu cho bột để thuận tiện khi đọc kết quả). Đánh giáđộ phân hủy kiềm: sau thời gian ủ ấm, lấy hộp nhựa ra và quan sát bằng mắt về hình dạng, mức độ kiềm phân hủy của từng hạt sen trong mẫu thử và dựa vào mẫu chuẩnvới thang điểm 1-7.

- Lần lượt cho vào ống nghiệm 1 mL mẫu thử ở mỗi độ pha loãng và bổ sungthêm1mLDPPH0,2mM,lắcđều,đểyêntrongtối30phút,sauđóđomậtđộhấpthụquang ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ UV-Vis (U-2900, Hitachi, NhậtBản).Chấtđốichiếuascorbicacidcũngđượctiếnhànhtươngtự. Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) có30g/Lsucrosevà8g/Lagar[70].(Phụlục11),bổsungriênglẻhoặctổhợpcácchấtkích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin với nồng độ khác nhau tùytừng thí nghiệm. Rửa mẫu bằng xàphòng loãng 3 lần, mỗi lần 5 phút, tiếp theo rửa dưới vòi nước chảy cho sạch, rửatiếp bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi đem vào phòng cấy để tiếp tục khử trùng.Trong tủ cấy, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 30 giây.

Tiếp tục khửtrùng bằng HgCl20,1% từ 6-17 phút để xác định thời gian khử trùng mẫu thích hợp.Mẫu hạt được rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần, dùng dụng cụ cấy vôtrùng tách đôi phần hạt theo chiều dọc để thu tim sen. Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chươngtrình thống kê trong Excel 2010 và phương pháp phân tích Duncan‟s test(p<0,05)bằngchươngtrìnhSPSS(ver.20.0).