Nghiên cứu bằng sinh học phân tử về vi khuẩn và kháng thuốc gây viêm phổi thở máy
MỤC LỤC
ĐẶTVẤNĐỀ
Chúng tôiđặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh VK gây VPTMgiữa hai phương pháp định danh VK dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16S-rRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhómV K g â y V P T M phân bố như thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc làbao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK mang gene kháng thuốc với MIC haykhông?. Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quantrọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập được những tác nhân liên quan đếnVPTM,giúpchoviệcđiềutrịBNtốthơn.
MỤCTIÊUNGHIÊNCỨU
Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng cáccephalosporin là thường gặp [81]. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trongviệc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang.
Chương1:TỔNG QUANTÀILIỆU
Địnhnghĩa
Nhưng không có thâm nhiễm lan tỏa hay tiến triển ở hai phổi khidựa vào hình ảnh X-quang hoặc CT ngực và bằng chứng vi sinh khi dựa vào tiêu chíchẩnđoánxâmlấnbằng nội soiphế quảntại giường[40],[86]. Mặc dù khái niệmrừ ràng như vậy, nhưng hơn năm thập niờn qua liờn tiếp cú rất nhiều định nghĩaVPTM được ra đời như định nghĩa của CDC 2014, nhưng không có định nghĩa nàođược chấp nhận rộngrãi toàn cầu.
Tỉlệmới mắccủaviêmphổi thởmáy
VPthùy có thể bỏ sót, xét nghiệm VK học có thể cho kết quả âm tính mặc dù có sự hiệndiện của VP, các nhà bệnh học có thể không đồng tình về các tiêu chuẩn đã đượcđưa ra [41]. Chính vì vậy, cho tới hôm nay tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán VPTMvẫn chưa có, sẽ có rất nhiều những NC mới đầy thuyết phục về lĩnh vực này ra đờitrongtươnglai[42],[61].
Tỉlệtửvong
Ngược lại, theo Cook và cộngsự đã tiến hành NC trên 1.014 BN thở máy, nguy cơ cộng dồn cho VPTM tăng lêntheo thời gian thở máy. Điều này biện minh cho việc tiếp cận mới nhằm cải thiện quản lý BN thở máybao gồm các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn, chẩn đoán sớm hơn, và điều trịtíchcựchơn[41].
Bệnhnguyên
PCR và giải trình tự gene 16S-rRNA chothấy tính hữu dụng chuyên biệt trong định danh VK thường gặp, VK hiếm, VK mọcchậm, VK không thể cấy được và các bệnh lý nhiễm khuẩn cho kết quả cấy âm tính.Áp dụng kỹ thuật cao này trong chẩn đoán VK học không chỉ cung cấp chẩn đoánbệnh nguyên về bệnh truyền nhiễm mà còn hỗ trợ chọn lựa cũng như thời gian dùngkháng sinh và công tác kiểm soát nhiễm khuẩn thật hiệu quả. T r o n g thậpkỷqua,cácdựángiảitrìnhtựbộgeneVKđãhoàntấtchophépcác NCvềphát sinh loài VK bằng cách sử dụng nhiều gene khác nhau và toàn bộ bộ gene [96].PCR và giải trình tự đã phát triển nhanh chống, nhờ vậy giải trình tự gene 16S-rRNA đã tạo đột phá trong khâu định danh VK trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm sinhhọccũngnhư cácVKđãphânlậptừ khoavisinhlâmsàng[100].
Cácyếutố nguycơ
Kết quả tương tự khi quansát trên 250 BN xảy ra VPTM rất sớm (≤ 48 giờ thở máy) cũng xác định được cácyếu tố nguy cơ VPTM như hồi sức tim phổi, dùng an thần liên tục và dùng khángsinhtrướcđócóORlầnlượtlà5,13, 4,4và0,29. Khi quansát bằng kính hiển vi điện tử ở 25 ống nội khí quản cho thấy 96% phát triển khuẩnlạc, 84% VK được bao phủ bởi màng sinh học hoặc glycat hóa (biofilm or glycalyt)[41].
Chẩnđoán
Ngoài ra, dựa vào kết quả MIC bác sĩ có thể điều chỉnh liều và cách cho khángsinh cho BN nhằm đưa điểm gãy PK/PD của kháng sinh lên bằng hay cao hơn MICcủa kháng sinh đối với VK để đạt được hiệu quả điều trị [21]. Các NC khác phát hiện trình tự kháng kháng sinh sử dụng multiplex real-time PCR và các hạt phát huỳnh quang xen vào (intercalating fluorophores) (như:SYBR Green) hoặc các đầu dò lai (or hybridization probes).
Chương2
- Tiêuchuẩnchọnmẫu
- Phươngpháptiếnhành
Adapter 2μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel trP1 2μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel Bst2.0WarmStartDNAPolymerase 1μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel T4DNALigase 6μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel EndRepairDNA 60μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel. Nuclease-freeWater 25μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel IonPGM™Hi-Q™ ReagentMix 800μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel IonPGM™Hi-Q™EnzymeMix 50μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel Thưviện(đãphaloãng) 25μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel IonPGM™Hi-Q™ ISPs 100μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidimel.
Chương3:KẾTQUẢNGHIÊNCỨU
Địnhdanhvikhuẩndựatrêngiải trìnhtựgene16S-rRNA
Ngoài ra còn có các mẫu khác như 4 mẫuEscherichiacoli,4 mẫuStaphylococcus aureusvà 4 mẫuBurkholderia cepacia.Các loài còn lạiEnterobacter cloacae, Haemophilus influenzaevàStenotrophomonas maltophiliađều có một mẫu (phụ lục 10). Cả hai loài vi khuẩnKlebsiellaspp (bao gồmKlebsiellapneumoniaevàKlebsiellaspp)vàHaemophilusspp(baogồmHaemophil usinfluenzaevàHaemophilusspp)đềuchiếmtỉlệ5,7%.Đốivớic á c l o à iBurkholderia spp (bao gồmBurkholderia cepaciavàBurkholderiaspp) chiếm tỉ lệcaotiếptheo là5,4%.Cácloài vi khuẩn cònlạichiếmtỉlệdưới3,5%.
TínhđộnhạyvàđộđặchiệucủaPGM
Có 19trong 76 trường hợp không có sự đồng thuận giữa vi sinh kinh điển và giải trình tựgene 16S-rRNA đối với chín loài VK gram âm, hiếu khí, dễ mọc được xác định làtácnhângâyVPTM.ĐólàcácVKthườngthấytrênlâmsàngđượcphânlậpđượctừ. Tiếptheo là các trực khuẩn Gram âm yếm khí tùy nghi chiếm 6 loài và các cầu khuẩnGram dương yếm khí tùy nghi chiếm 4 loài. Các loàiVK còn lại như: cầu khuẩn và liên cầu Gram dương yếm khí tùy nghi, cầu trựckhuẩn Gram dương yếm khí tùy nghi, cầu khuẩn Gram âm yếm khí và xoắn khuẩnđềucómộtloài.
Kếtquảkhángsinhđồ
Tuy nhiênAcinetobacterspp kháng với hầu hết cáckháng sinhcòn lại được thực hiện kháng sinh đồ.Acinetobacterspp khángv ớ i nhóm carbapenem bao gồm imipenem và meropenem trên 90%. Bên cạnh đó đối với nhómkháng sinh fluoroquinolone,Klebsiellaspp kháng với ciprofloxacin và levofloxacinlầnlượtlà53%và57%.NgoàiraKlebsiellasppkhángvớiertapenem46%. Tuy nhiên đối với các kháng sinh cephalosporinethế hệ ba và bốn, cefoperazon - sulbactam, piperacillin - tazobactam, carbapenemnhómhai,nhómaminoglycosidevànhómfluoroquinolone,Pseudomonass p pkhángtừ 60đến86%.
Kếtquảkháng sinhđồ MICdựatrênE-test
Ngoài ra, đối với hoạt chất sulbactamđơn lẻ, cựng với tiờu chuẩn MIC ≥ 16 àg/ml được gọi là khỏng, thỡ khụng cú trườnghợp nào trong 39 trường hợpK. Đối với levofloxacine, tất cả 9 trường hợp phân lập đượcEscherichia coli,đều cú kết quả khỏng sinh đồ định lượng MIC ≥ 8 àg/ml. Tương tự với tiờu chuẩnkhỏng sinh đồ định lượng, với giỏ trị MIC ≥ 8 àg/ml là đề khỏng đối với imipenem.Như vậy kết quả cho thấy có tới 3/9 trường hợpEscherichia coliđề kháng đối vớiimipenem.
Chương4:BÀNLUẬN
Địnhdanhvikhuẩn 1. Dựatrênvisinhkinhđiển
Bệnh nhân được xác định chẩn đoán VPTM dựa trên thang điểm CPIS ≥ 6.Đàm được hút qua nội khí quản, phương pháp li trích DNA bằng cột, giải trình tựtrênhệthốngPyrosequencing.Kếtquảchothấysốchủngvàloàipháthiệnđượclà 15loài.BaogồmcáctrựckhuẩnGramâmkhônglênmenđườngnhưP. Tuy nhiênvới số liệu của NC này, chúng tôi không thể hoàn toàn qui kết được tác nhân nào làthủ phạm gây VPTM nếu dựa vào giải trình tự trên hệ thống Ion Torrent PGM.Nhưng kỹ thuật này giúp cho các bác sĩ lâm sàng định hướng được các tác nhân khảdĩ gây VPTM ở các BN nặng. Đây là một thế mạnh của sinh học phân tử trong chẩn đoánvi sinh, góp phần định danh loài VK nhanh chóng mà không thông qua nuôi cấy.Điều đặc biệt hơn là sinh học phân tử cho phép tái khẳng định lại các loài vi khuẩncó kiểu hình bất thường mà vi sinh kinh điển có thể định danh chưa có kết quả cuốicùng.
Kếtquảkhángsinhđồ 1. Khángsinhđồkhuếchtán
Tuy nhiên VK này chưa ghinhận kháng với amikacin và nhạy với carbapenem nhóm hai hơn hai phần ba cáctrườnghợp.Hơnnữa,Enterobactersppkhángceftazidime,ceftriaxonevàpiperacillin - tazobactam chiếm một phần ba trường hợp. VKA.baumanniikhángvớikhángsinhnàylêntới55%.Hơnnữasốliệucủachú ngtôicho thấy không nhất quán với NC của chính chúng tôi tại khoa ICU bệnh viện NhânDân Gia Định 2011 và nhóm tác giả NC tại khoa ICU bệnh viện Chợ Rẫy năm 2010[5], [11]. Giả định này càng đượccủng cố thêm là qua số liệu NC của chúng tôi cho thấy không có sự khác biệt giữakết quả kháng sinh đồ khuếch tán trên các đĩa giấy có tẩm kháng sinh và kháng sinhđồ định lượng dựa trên E-test đối với các kháng sinh khác.
KẾTLUẬN
Khángsinhđồcủavikhuẩngây viêmphổithởmáy
Kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa giấy tẩm kháng sinh:Gần 85% các vikhuẩn phân lập được là đa kháng, kháng cephalosporin thế hệ ba và bốn từ 63%. Kháng sinh đồ Etest và đĩa giấy có kết quả tương đương nhau đối với các vikhuẩn gây viêm phổi thở máy phân lập được.
TÀILIỆUTHAMKHẢO
CDC(2014),"CDC/
Cook Deborah, Guyatt Gordan, Marshall John et al (1998), "A comparison ofsucralfateandranitidineforthepreventionofuppergastrointestinalbl eedinginpatientsrequiringmechanicalventilation.CanadianCriticalCareTrials Group".NEnglJMed,338(12),pp.791-797. Pugin J (1991), "Diagnosis of Ventilator-associated Pneumonia by BacteriologicAnalysis of Bronchoscopic and Nonbronchoscopic “Blind” BronchoalveolarLavage Fluid".Am Rev Respir Dis. 2006),"AsimplifiedreversetranscriptasePCRforrapiddetection of Mycobacterium leprae in skin specimens".FEMS Immunol MedMicrobiol,48(3),pp.319-328. Tatsuya T, Tohru M-A, Yasuyuki K, Norio O, Nozomi T, Nguyen Viet Hung,Doan Mai Phuong, Truong Anh Thu, Nguyen Gia Binh, Nguyen Quoc Anh,Tran Thi Thanh Nga, Pham Hong Truong, Phan Thi Xuan, Le Thi Anh Thu,Nguyen Truong Son and Teruo Kirikae, Tatsuya T (2013), "Emergenece of16SrRNAmethylase-.
PHỤLỤC
Phụlục4:Quy trìnhnộisoiphếquảntạigiường
Dùng gạc thấm nước cất lau sạch cần soi và gắnđầu dây hút đàm vào máy soi, hút nhẹ tráng kênh sinh thiết bằng nước cất vô khuẩn4-5 lần, bôi trơn cần ống soi bằng xylocaine jelly 2% vô khuẩn. Sát khuẩn đầu ống nội khíquản nơi đưa ống soi vào bằng cồn 900, sau đó được lau sạch đầu nối ống nội khíquản bằng gạc vô khuẩn, quan sỏt bệnh nhõn và màng hỡnh theo dừi trong suốt quỏtrỡnh soi. Nối một đầudây của lọ hút đàm vào đầu nối của ống nội soi, đầu còn lại nối vào dây hút đàm củabình hút áp lực âm một chiều, tiến hành rửa phế quản phế nang, mỗi lần bơm 5-10ml nước muối sinh lí vô khuẩn, tổng lượng nước muối sinh lí bơm vào cho một lầnsoi không quá 120ml,h ú t s ạ c h d ị c h r ử a.
Phụlục7:Biệnluậnkếtquả kháng sinhđồtheoCLSI2014
PHÁCĐỒĐIỀUTRỊ
Nếu kết quả kháng sinh đồ là PDR ( kháng tất cả kháng sinh): sử dụng phác đồkhángsinhkếthợpvới gợiýbêndưới,thờigiankéodài14ngày.