Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng

Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp một môi trường phù hợp cho sự di chuyển và chín muồi của các giao tử, thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết những sản phẩm do ống dẫn trứng tiết ra, từ đó có thể giúp cho việc phát triển các môi trường phù hợp để nuôi phôi.

Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng .1 Cấu tạo tinh trùng

Biến đổi trung thể: ở kỳ cuối giảm phân 2, trung thể tách ra làm hai hạt nhỏ và di chuyển về phớa sau, trung thể gần nằm trong hố lừm của màng nhõn, trung thể xa phát ra sợi trục. Sự biến đổi nhân: Nhân mất nước, nhỏ lại, trở nên đồng nhất và bắt màu đậm Sự hình thành thể đỉnh: Trong tinh tử, hệ thống golgi gồm một hệ thống các bể chứa dẹp và nhiều không bào.

Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường

Dịch nang trứng chứa các thành phần giống như trong huyết thanh, ngoài ra nó còn chứa các protein được tổng hợp trong nang trứng, các enzyme đặc hiệu phục vụ hoạt động của buồng trứng như: ATPase, lactate dehydrogenase, transaminase, alkaline phosphatases và chứa nhiều loại hormone quan trọng tới sự hình thành và phát triển của nang trứng như Gonadotrophin, đặc biệt là các steroid như: oestrogen, androgens và progestogens [41], [70]. Cũng theo nghiên cứu của ông cho thấy hoạt tính SOD của dịch nang thu được từ các nang trứng có kích thước 2-6 mm có mức hoạt tính SOD cao gấp 7, 2 lần so với trong huyết thanh bê, tuy nhiên huyết thanh bê đã được sản xuất hàng loạt từ nhiều năm nay và có giá trị thương mại rất lớn còn dịch nang trứng thì mới được tách chiết mang tính chất phục vụ tại chỗ vì việc tách chiết mất nhiều thời gian và nhân lực, khả năng nhiễm khuẩn lại cao hơn so với huyết thanh bê.

Sự hoạt hóa tinh trùng

Người ta cho rằng các giai đoạn đầu tiên của hoạt hoá liên quan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh (Seminiferous Tubule), mào tinh (Epididymis), ống dẫn tinh (Vas Deference) và tinh thanh (Seminal Plasma). Trong khi di chuyển từ tinh hoàn qua mào tinh (Epididymis), tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục có khả năng thụ tinh và dự trữ ở đuôi dịch hoàn phụ đến khi được giải phóng ra trong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu [55]. Bổ sung Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng: Tinh trùng khi tiếp xúc với Albumin huyết thanh bò (BSA) trong một dung dịch muối sinh lý phù hợp có thể hoạt hoá tinh trùng trong ống nghiệm do đó BSA đã được sử dụng thường xuyên trong môi trường nuôi dùng trong thụ tinh ống nghiệm.

Người ta tin rằng cholesterol, chất ổn định màng tế bào, được loại bỏ khỏi màng tinh thanh tinh trùng trong khi hoạt hoá; ion kẽm, cũng là chất ổn định màng tế bào cũng có thể loại bỏ trong các giai đoạn đầu của quá trình hoạt hoá. Gần đây hơn, Daya và cs (1987) đã sử dụng cột hạt thủy tinh để tách tinh trùng ở người; họ nhận thấy kỹ thuật này có thể tin tưởng được và là một kỹ thuật có kết quả ổn định để tách các tinh trùng có hoạt lực từ những tinh dịch có chất lượng kém [9].

Thụ tinh trong ống nghiệm .1 Sự thụ tinh

Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duy trì khả năng thụ tinh như tỷ lệ về khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn 50% sau 2 giờ được bổ sung vào môi trường chứa tế bào trứng [39]. Mật độ tinh trùng: Trong số các tinh trùng đem đi thụ tinh, ta không thể xác định được tỷ lệ các tinh trùng thực sự được hoạt hóa là bao nhiêu, do đó trong quá trình thụ tinh cần phải sử dụng lượng tinh trùng rất lớn. Khi nhiều tinh trùng cùng vào trứng, sẽ cùng tham gia vào quá trình dung hợp nhân và kết quả là hình thành lên các thể lưỡng bội, tam bội và thậm chí là thể khảm làm cho hợp tử tạo ra không thể phát triển bình thường [67].

Các nhà khoa học đã nghiên cứu rất nhiều phương pháp khác nhau để giải quyết vấn đề này như bổ xung vào môi trường thụ tinh tế bào ống dẫn trứng, tế bào nang hay giảm số lượng tinh trùng tham gia thụ tinh. Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung vào việc nghiên cứu điều khiển sự liên kết của tinh trùng với màng sáng của trứng trong quá trình thụ tinh nhằm hạn chế sự xâm nhập của nhiều tinh trùng vào một trứng làm giảm hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng [67].

Nuôi phôi trong ống nghiệm .1 Quá trình phát triển phôi

Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tinh tại thời điểm thụ tinh, chất lượng trứng mang thụ tinh và môi trường thụ tinh [32], [59], [26]. Phôi lợn có thể phát triển tốt trong ống dẫn trứng chuột, tuy nhiên phải là chuột trưởng thành vì ống dẫn trứng chuột chưa trưởng thành không đủ điều kiện để phôi vượt qua giai đoạn 4 tế bào [13]. Sau nhiều nghiên cứu các nhà khoa học đã tạo ra một số môi trường nuôi phôi xác định chứa các thành phần cần thiết đảm bảo cho sự phát triển của phôi giống như điều kiện trong tử cung con cái.

Có rất nhiều môi trường khác nhau như môi trường Whitten cải tiến (mWM), môi trường NCSU -23 (North Carolina State University), môi trường ISU (Iowa) và môi trường Beltsville 3 (BECM-3) , môi trường NCSU -37 (North Carolina State University) [60]. Tuy nhiên, từ giai đoạn phôi nang đến giai đoạn phôi nang dãn nở, huyết thanh, axit amin, và các chất khác đóng một vai trò quan trọng đến sự phát triển của phôi, do đó nhu cầu dinh dưỡng cao hơn một khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang.

Cất giữ lạnh phôi

Mối liên hệ giữa tốc độ làm lạnh và sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào thể hiện qua Hình 8 Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hoá học ngoại bào. Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng, và vì vậy nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên và cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh nội bào. Đối với phương pháp đông lạnh chậm, phôi được chuyển vào môi trường có chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp.

Ngay sau khi tạo mầm tinh thể đá, đá sẽ được hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ chứa phôi, và việc hạ nhiệt độ vẫn được thực hiện với tốc độ 0,30C/phút xuống –300C, từ nhiệt độ này, phôi được chuyển vào nitơ lỏng để bảo quản [51], [63]. Thuỷ tinh hoá là thuật ngữ chỉ quá trình đông cứng mà không tạo thành tinh thể đá không có sự cô đọng các chất hoà tan như trong các phương pháp đông lạnh truyền thống; có sự tăng đột ngột độ quánh trong môi trường lưu phôi, tạo nên chất rắn dạng thuỷ tinh.

Giải đông phôi

Phương pháp đông lạnh nhanh là những phương pháp đông lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xảy ra rất nhanh. Phôi sau khi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào niơ lỏng mà không cần phải sử dụng máy đông lạnh có kiểm soát nhiệt đã được lập trình sẵn. Một trong những phương pháp đông lạnh nhanh được nghiên cứu rộng rãi là phương pháp thuỷ tinh hoá (vitrification).

Sau đó phương pháp này đã được nhiều tác giả nghiên cứu thành công để đông lạnh phôi đông vật có vú [4], [11].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .1 Thiết bị

Chúng tôi quan sát trứng dưới kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 40x và phân trứng thành 4 nhóm như sau: Nhóm loại A, là loại tốt nhất gồm những trứng có nhiều lớp tế bào nang bao quanh, tế bào chất đồng đều, đậm màu và màng sinh chất nguyên vẹn. Trứng sau khi nuôi được đánh giá bằng sự kết hợp hai phương pháp là quan sát độ giãn nở của lớp tế bào nang bao quanh và chọn ngẫu nhiên một trứng trong giọt nuôi để loại bỏ cumuls và đánh giá sự thành thục của trứng dựa vào sự xuất hiện của thể cực thứ nhất [17]. Dựa trên quan sát độ giãn nở lớp tế bào cumulus chia trứng theo các mức độ: 0 (lớp tế bào nang không giãn nở hoặc đã bị thoái hóa chỉ còn chưa tới 1 lớp tế bào nang bám vào trứng hoặc lớp tế bào nang đã bị bong tróc hoàn toàn), 1 (chỉ có một lớp tế bào nang ngoài cùng giãn nở), 2 (Độ giãn nở trung bình, một nửa lớp tế bào nang của trứng giãn nở), 3 (Lớp tế bào nang giãn nở hoàn toàn bung ra tạo hình phóng xạ).

Các tế bào nang giúp trứng ngăn cản stress oxi hóa, thúc đẩy quá trình thành thục, ngoài ra nó còn đóng vai trò trong quá trình ngăn cản bớt sự thụ tinh đa tinh trùng. Sau khi đã pha loãng chuyển tinh trùng vào đĩa vô trùng sau đó phủ dầu khoáng và ủ trong tủ nuôi cấy ở điều kiện 38,5oC, độ ẩm 95% và 5% CO2 để chuẩn bị cho thụ tinh.

KIẾN NGHỊ