Tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú

Mục đích yêu cầu

- Sàng lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trong điều kiện thí nghiệm.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Vật liệu nghiên cứu
• Phương pháp nghiên cứu
• Phương pháp bố trí thí nghiệm

Tiếp tục huyền phù eppendorf chứa phần tử lớn trong dung dịch TN1X lần 2 và làm tương tự các thao tác trên để thu tiếp dịch trong. Hỗn hợp dịch trong của 2 lần ly trích trên được lọc qua màng lọc virus cú kớch thước lỗ 0,45 àm, thu nhận chất lọc và bảo quản dịch virus ở -20oC. Dịch chiết virus và hỗn hợp dịch virus và thuốc được cảm nhiễm trên tôm sú không nhiễm bệnh đã được nuôi thuần từ 7 – 10 ngày bằng cách tiêm 0,05 ml dịch chiết virus hoặc hỗn hợp dịch virus và thuốc vào đốt cơ bụng thứ 2 hay 3.

Sau khi cảm nhiễm, theo dừi tụm dựa vào cỏc dấu hiệu lõm sàng, tiến hành thu mẫu tôm bằng cách lấy phần mang cho vào cồn 95 % để cố định mẫu. Dùng để kiểm tra sự hiện diện của virus gây hội chứng đốm trắng trong mẫu hỗn hợp sau khi trộn chung dịch virus và hợp chất thuốc. Sau khi chuẩn bị mẫu và chạy phản ứng PCR, tiến hành điện di trên gel Agarose và đọc kết quả, nhận biết sự hiện diện của WSSV nhờ so sánh kích thước của chúng với thang DNA chuẩn cùng với mẫu đối chứng dương và âm.

Cũng như PCR định tính, phương pháp PCR định lượng dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của bộ gen virus WSSV. Tuy nhiên khác với phương pháp PCR định tính sản phẩm sau khi khuếch đại phải đem điện di và đọc kết quả trên bàn đọc UV, sản phẩm khuếch đại trong phương pháp PCR định lượng được đánh dấu bằng probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM) ở đầu 5’ và chất hấp thu huỳnh quang (ở đầu 3’). Trong khi chạy PCR, đầu đọc iQ Realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu bằng cách nhận biết và thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra ở bước 60o trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ hoạt tính 5’ - 3’exonuclease của Taq polymerase tách đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang của probe ra khỏi khuôn mẫu, lúc này FAM ở dạng tự do sẽ phát quang và được thu nhận và xử lý.

Nếu probe không gắn được vào khuôn hoặc hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease không có thì chất phát huỳnh quang phát ra bao nhiêu sẽ bị hấp thu bấy nhiêu. Sau khi kết thúc chương trình, kết quả được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và biết được nồng độ virus ban đầu của mẫu thử dựa vào các nồng độ DNA chuẩn và chúng ta sẽ đo được nồng độ DNA trong các mẫu thử bằng đường biễu diễn chuẩn (Standard curve) hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng dộ DNA trong các mẫu chuẩn. Xác định độ tiêu hao Oxy hoá học (COD) trước khi bố trí thí nghiệm: Oxy hoá mẫu nước bằng Permanganat Kali, sau đó tiến hành chuẩn độ bằng Thiosulphate Natri sử dụng hồ tinh bột làm chất chỉ thị.

Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA. Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết được khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng

Trong trường hợp này hợp chất D2 đã làm thay vai trò của NaOH – SDS trong việc ly trích DNA. Nếu so mức độ sáng tối chụp được của hợp chất D2 ở các nồng độ này với dịch virus thử nghiệm thì ta thấy yếu hơn. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất D2 lên virus WSSV là khá tốt nhưng chưa cao.

Kết quả điện di cho thấy trên bản gel sau khi điện di xuất hiện vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 tương tự như trường hợp của hợp chất D2 ở trên. Nếu so sánh về mức độ sáng tối thì vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 yếu hơn so với vạch sáng ở giếng đối chứng dương và dịch virus thử nghiệm. Tuy nhiên so với hợp chất D2 thì hợp chất B ở các nồng độ tương tự có độ sáng mạnh hơn.

Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất B lên virus WSSV là cao hơn so với hợp chất D2. Điều này cho thấy ở hợp chất B nồng độ đã có vai trò nhất định trong sự phá vỡ lớp vỏ protein virus. Nồng độ càng cao trong phạm vi nhất định thì hiệu quả tác dụng càng mạnh.

Những kết quả này được đánh giá bằmg mắt thường và chỉ là những thí nghiệm In vitro, do đó để biết được hàm lượng DNA trong các mẫu thử trước và sau khi sử dụng các hợp chất có sai khác ý nghĩa hay không, các hỗn hợp này (D2 và B) được thực hiện với phản ứng Realtime PCR. Đồng thời để xác định được khả năng bất hoạt thật sự của các hợp chất lên virus WSSV, chúng ta cần phải cảm nhiễm hỗn hợp này vào cơ thể tôm. Dựa vào kết quả sàng lọc 3 hợp chất như trên, chúng tôi chỉ tiến hành thử nghiệm đối với các hợp chất D2 và B.