Xây dựng quy trình định lượng virus Cytomegalovirus (CMV) trong máu bằng phương pháp Real-time PCR

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Máy ủ nhiệt, máy ly tâm siêu tốc, máy Real-Time PCR, máy vortex, máy vi tính các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá primer, thiết kế phản ứng PCR, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ hút khí độc, bàn đèn tử ngọai…. - Cần tránh cấu trúc thứ cấp ở nhiệt độ bắt cặp hay không, (kiểm tra bằng cách sử dụng chương trình mfold: http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/ mfold/, hoặc xem tập san Bio- Rad 2593). - TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp).

Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6- carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có. Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0 của IDT (http://scitools,idtdna,com/ analyzer/oligocal,asp).  Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với gen CMV.

Phản ứng Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe được thiết lập với 5 àl DNA-CMV với 20 àl master mix pha từ iTaq DNA Polymerase (Bio-Rad), phản ứng Real-Time PCR sử dụng PCR Amp/Cycle Graph với FAM-490. Nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp primer sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm ký sinh không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của primer vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting temperature) của DNA mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP.

Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polymerase, hiệu suất thu sản phẩm thấp hoặc không có sản phẩm, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu (primer sai vị trí). Nồng độ primer thường 0,2M là đủ cho các primer tương tự, cũng có thể sử dụng đến 3M, nhưng tỷ lệ giữa primer và khuôn cao có thể cho kết quả khuyếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân primer. * Thăm dò nồng độ TaqMan probe để có cường độ huỳnh quang là cao nhất, không phải hàm lượng TaqMan cao là cho cường độ phát huỳnh quang cao, ngược lại sẽ làm các phân tử TaqMan probe quá gần nhau nên huỳnh quang phát ra từ đầu reporter của TaqMan probe được thủy giải sẽ bị các quencher của các TaqMan probe khác hấp phụ.

Trên lý thuyết, chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 để kiểm tra sự bắt cặp của primer trên genome của một số loài cùng họ như HSV1, HSV2, EBV và một số loài khác HBV, HCV, HPV, MTB…. Để biết sản phẩm khuyếch đại thu được là đặc hiệu của vùng gen UL123–CMV đã thiết kế theo gene bank, sản phẩm phải được gửi đi giải trình tự nucleotide, ở công ty Macrogenn Inc (Hàn quốc). Nguyên tắc đoạn DNA cần được giải được chạy Real-Time PCR, sau đó mỗi mạch của phân tử DNA sẽ bắt cặp với một primer, thường là mổi sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR, xảy ra với sự có mặt của dideoxyribonucleotide đã được đánh dấu bằng mỗi màu khác nhau.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CMV TRÊN MỘT SỐ BỆNH PHẨM Sau khi tối ưu hóa quy trình định lượng CMV bằng Real-Time PCR, chúng tôi tiến hành ứng

Tóm lại,qua khảo sát trên 20 mẫu máu và 22 mẫu nước tiểu được xác định dương tính với kháng thể IgG-CMV, chúng tôi thu được 4 mẫu nước tiểu và 4 mẫu huyết thanh dương tính với phản ứng Real-Time PCR, hai mẫu máu được xác định dương tính với kháng thể IgM-CMV, có một. Tuy nhiên, qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy không phải có kháng thể IgG-CMV hay IgM-CMV là có lượng virus trong máu cao đủ để định lượng CMV, giữa hàm lượng kháng thể IgG-CMV hoặc IgM-CMV và hàm lượng virus trong mẫu nhiễm cần nghiên cứu thêm để thấy được mối tương quan của chúng.