Nghiên cứu chế tạo kháng thể từ lòng đỏ trứng gà để phòng ngừa tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn
MỤC LỤC
Yếu tố xâm nhập của E. coli
Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đợc hàng rào này sẽ bị bắt bởi đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [2], [6].
Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli
Khối lợng phân tử của heamolyzin khoảng 300.000 Da, đợc cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [63].
Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli
Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp [19]. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E.
Độc tố của E. coli
Những kháng thể đặc hiệu trong sữa đầu hoặc ở niêm mạc ruột ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột non và trung hòa hoạt động của độc tố đờng ruột, độc tố tế bào của E. Hiện tại, phòng bệnh bằng trộn thuốc vào thức ăn là liệu pháp chính đối với những cơ sở bị lây nhiễm ở hầu hết các nớc trên thế giới, mặc dù có rất nhiều phản đối từ ngời tiêu dùng, nó có thể làm suy giảm miễn dịch và gây ra kháng thuốc. Để phòng bệnh, giá trị dinh dỡng của thức ăn có thể đợc giảm bớt nhờ tăng hàm lợng chất xơ lên 15- 20%, giảm protein thô và năng lợng tiêu hóa còn một nửa giá trị trong khẩu phần bình thờng, cung cấp mức dinh dỡng thấp chỉ đủ để duy trì tăng trọng hàng ngày nhỏ hơn 1% khối lợng cơ thể trong 2 tuần sau cai sữa.
- Kháng thể (tiếng Anh: antibody): là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng nh các tơng bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virut.
Đặc tính và ứng dụng
Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đề hấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loại kháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinh kháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó. Tuy nhiên, ta không thể có đủ lợng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhng có một điều thú vị là kháng thể trong huyết thanh gà lại đợc truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà [36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh đợc các bệnh tật. Ngày nay, ngời ta đã chứng minh và có nhiều bằng sáng chế về sản xuất kháng thể trong lòng đỏ trứng, cho đến nay ngời ta đã đợc xác định đợc bản chất của kháng thể đó là IgY do các tài liệu khác còn gọi là: IgG gà (chicken IgG), IgG lòng.
IgY có chức năng tơng tự nh kháng thể của thỏ và động vật có vú khác, do đó nó có giá trị kinh tế hơn đợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (đặc biệt với việc sản xuất các kháng thể đơn dòng).
Vật liệu và phơng pháp
- Động vật thí nghiệm
Bệnh phẩm là phủ tạng lợn đợc lấy bằng cách đa cả con lợn bị phù đầu đã chết hoặc gần chết về phòng thí nghiệm, mổ lấy bệnh phẩm gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, ruột, gan, lách, phổi trong trực tràng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Chọn khuẩn lạc có dạng S, có màu vàng đặc trng trên môi trờng thạch Istrati cấy sang môi trờng Mac Conkey và môi trờng Brilliant green agar bồi dỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chất mọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết. Trong môi trờng dinh dỡng Nutrient Broth đã bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch đờng cần kiểm tra, cấy vi khuẩn vào, bồi dỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả.
+ Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy kháng huyết thanh nhóm trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, huyễn dịch vi khuẩn bên kia phiến kính không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm).
Kết quả và bàn luận
Nuôi cấy đặc hiệu cho E. coli, sàng lọc vi khuẩn tạp
Kết hợp với các môi trờng khác nh là môi trờng thạch máu, môi trờng nớc thịt, môi trờng thạch thờng, môi trờng yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm giống với E. Qua bảng 3 thấy rằng: từ 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn có dấu hiệu mắc bệnh sng phù đầu và ỉa chảy do E. Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ 85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với E.
Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên tiêu bản khi nhuộm Gram: vi khuẩn có dạng trực khuẩn, hai đầu tròn, bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ.
Tiến hành các phản ứng sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập đợc
Vì vậy chúng tôi đã chọn 50 chủng dung huyết trên để thực hiện các bớc tiếp theo trong quá trình chọn lọc E. Sau khi xác định khả năng dung huyết của các chủng, chúng tôi cấy 50 chủng này vào môi trờng thạch bán lỏng trong ống nghiệm chữ U (cấy ở một đầu ống nghiệm) nuôi ở điều kiện 37oC, cứ sau 6 tiếng đọc kết quả 1 lần. Mẫu dơng tính là mẫu mà vi khuẩn có khả năng phát triển ra môi trờng xung quanh và phát triển sang nhánh bên của ống nghiệm chữ U.
Còn mẫu âm tính là mẫu mà vi khuẩn không có khả năng phát triển ra môi trờng xung quanh, chúng chỉ có thể phát triển tại vị trí cấy giống, sau đây là kết quả cụ thể.
Xác định độc lực của từng chủng E. coli đã phân lập
Ngoài ra, kết hợp với Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ơng, sử dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi còn xác định đợc sự có mặt của các gen độc tố của E. Nh vậy, từ 29 chủng đã phân lập đợc, qua việc xác định độc lực của từng chủng. Chúng tôi đã chọn lọc ra đợc 13 chủng có độc lực, tiếp theo chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu tính kháng nguyên của các chủng này.
Xác định tính kháng nguyên của từng chủng E. coli đã phân lập
+Có 10 chủng/13 chủng gây cho chuột có hàm lợng kháng thể khá cao (hiệu giá. kháng thể từ 1/48 trở lên), thể hiện tính kháng nguyên tốt của các chủng E. +Trong số 13 chủng này chỉ có 3 chủng có tính kháng nguyên rất yếu, thể hiện qua hiệu giá kháng thể trong huyết thanh chuột không cao hơn nhiều so với huyết thanh của chuột đối chứng, đó là các chủng E15, E20, E24, do đó chúng tôi tạm thời loại bỏ chủng này. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này ngoài việc chế tạo kháng thể chống lại các kháng nguyên thân của vi khuẩn, còn phải chế tạo đợc các kháng thể đặc hiệu để trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Để có thể chế tạo đợc kháng thể kháng độc tố, bớc đầu tiên là chế tạo đợc kháng nguyên độc tố an toàn để miễn dịch cho động vật thí nghiệm.
Nghiên cứu động thái sinh trởng của E. coli
Nghiên cứu môi trờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố.
Nghiên cứu môi trờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố E. coli
Sau khi nuôi cấy trên các môi trờng có các công thức nuôi cấy khác nhau, dịch nuôi cấy sống đợc ly tâm ở 7000g/15 phút, thu phần nớc trong, lọc qua màng lọc có kích thớc lỗ lọc 0,2 μm, dung dịch thu đợc sau khi lọc gọi là dịch chứa độc tố, ký hiệu là T2, chúng tôi tiến hành tiêm dịch qua lọc T2 cho chuột bạch 18 – 20 gam. Qua bảng 13 chúng tôi thấy độc tố này yếu, tiêm dới da không phát hiện đợc (chuột không chết) mà chỉ phát hiện đợc bằng tiêm phúc xoang hoặc tĩnh mạch. Trớc khi chuột chết có thể co dật hoặc không; cũng có trờng hợp chuột chết nhanh, co dật mấy lần rồi chết, sau 48 giờ con nào không chết thì hồi phục dần.
Kết quả cho thấy từng chủng có độc lực của độc tố khác nhau, từng chủng có thể làm chuột chết hoặc ốm khác nhau (chuột đối chứng không có hiện tợng này).
Nghiên cứu phơng pháp làm bất hoạt và giải độc
+Phơng pháp giải độc bằng phenol và thiomersal không những không mang lại hiệu quả giải độc mà còn làm tăng tính độc của độc tố, do đó không thể dùng hai hóa chất này để giải độc đợc.
Kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt
Dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc, độc lực giảm đi nhng vẫn có tính kháng nguyên.
Xác định tính kháng nguyên của giải độc tố
Huyết thanh đợc pha loãng theo cấp số 2 nh thờng quy, bổ sung kháng nguyên độc tố vào huyết thanh đã pha loãng theo tỷ lệ thể tích 1:1. Thành phần tham gia phản ứng gồm có, kháng nguyên độc tố đợc bố trí ở giếng trung tâm, còn các giếng xung quanh là huyết thanh chuột miễn dịch đợc pha loãng theo cấp số 2. Phản ứng ADP dơng tính một lần nữa khẳng định chắc chắn về tính kháng nguyên của độc tố, ngoài ra ta còn xác định đợc hiệu giá kết tủa, nghĩa là kháng nguyên độc tố gây miễn dịch mạnh.
+ Kháng độc tố trong huyết thanh chuột đợc miễn dịch giải độc tố có thể đợc phát hiện qua phản ứng kết tủa với kháng nguyên độc tố E.
