Ứng dụng của Enzyme trong Phương pháp Nhốt Gel
MỤC LỤC
Nhốt trong cấu trúc mạng Gel
Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành một chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và glucuronate có thể là một chuỗi (M M M) (G G G) hoặc có thể đó là (M. Khi cho hỗn hợp enzyme và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dịch CaCl2 sẽ tạo thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0.5 4mm) chứa enzyme bên trong. Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng.
Phương pháp nhốt gel trong hệ sợi
Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản. Để ổn định hạt gel có thể cho hạt gel khâu mạch trong dung dịch glutaraldehyde hoặc các chất khâu mạch khác.
Phương pháp siêu lọc (ultrafilitration)
Vật liệu cố định không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho các enzyme ổn định hoạt tính khi cố định. – Nối đồng hóa trị liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một liên hợp cao phân tử không hòa tan. Điều chế các enzyme cố định loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác.
Vì phản ứng enzyme thường xảy ra trong môi trường nước, nên vật liệu cố định tốt hơn cả là có chất ưa nước. Việc gắn enzyme có hiệu quả hơn cả khi điện tích của enzyme và của vật liệu cố định có dấu ngược nhau. Quá trình cố định enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu vật liệu cố định cố định có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của enzyme.
Giai đoạn hoạt hóa vật liệu cố định bằng cách đưa vào các nhóm chức năng có khả năng phản ứng hơn. Trường hợp khụng cần hoạt húa vật liệu cố định thể hiện rừ trong trường hợp copolymer của maleic alhydric và ethylen. Copolymer được dùng phổ biến làm vật liệu cố định để điều chế các dẫn xuất không tan của protease và một số enzyme khác.
Các chất mang có bản chất là polysaccharide ( OH) thường được hoạt hóa sơ bộ bằng cyanogen halogenur.
NCS)
Muối diazo của chất mang hoạt hóa có thể phản ứng không chỉ với nhóm amin mà cả nhóm phenol, imidizol của protein của enzyme. Phản ứng cộng hóa trị với enzyme xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thường và môi trương nước trung bình.
NaNO
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH [3]
Ngày nay, nhiều qui trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất. Năm 1973 hãng Clinton Corn (Mỹ) đưa vào sản xuất công nghiệp glucoisomerase chuyển hóa glucose thành fructose với tỉ lệ 1:1, thông thường được gắn với các polymer vô cơ qua các liên kết đồng hóa trị. Fumarase cố định chuyển hóa fumaric acid thành L succinic acid được thực hiện ở qui mô công nghiệp năm 1974, phản ứng xảy ra cho đến khi 80%.
6 APA là bán sản xuất để tổng hợp các loại penicilin khác nhau, lần đầu tiên được hãng Snam Progetti 1975 đã sử dụng penicillinamiolase cố định để sản xuaát penicillin. Các chế phẩm lactase cố định đã được chế tạo theo phương pháp khác nhau: nhốt trong sợi triacetate cellulose, liên kết đồng hóa trị với các polymer chứa silic, hấp thụ trên các chất trao đổi ion. Để thu nhận glucose phải sử dụng hai enzyme là amylase và glucoamylase phân cắt tinh bột thành các oligosaccharide, còn glucoamylase phân cắt tinh bột và tạo thành glucose.
Chế phẩm glucoamylase cố định được thu nhận bằng cách gắn enzyme trên silicagel, nhốt trong sợi triacetate cellulose hấp thụ trên DEAE Cellulose. Năm 1954 Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trên cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Enzyme cố định còn được dùng trong chẩn đoán bệnh, ngoài các ứng dụng điện cực enzyme, trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể giúp chẩn đoán nhanh và chính xác (kỹ thuật ELLISA).
Ngày nay, việc nghiên cứu enzyme cố định được tiến hành theo hướng ngày càng phức tạp dần, mô hình từ một enzyme riêng lẻ đến hệ thống nhiều enzyme, sẽ tiến đến tạo những cấu trúc trên phân tử có trật tự bao gồm nhiều phức hệ enzyme.
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 1. Các nghiên cứu trong nước
Ưu điểm phương pháp sản xuất liên tục nên năng suất tạo cồn tăng, ít đầu tư vốn, nấm men hoạt động liên tục (100 ngày) thay vì phải cấy và nhân giống hàng ngày nếu theo qui trình cũ. Nhóm nghiên cứu của Viện Sinh Học Nhiệt Đới kết hợp với bộ môn sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự nhiên năm 1994 nghiên cứu thử nghiệm tạo pepsin cố định và năm 1995 thử nghiệm tạo pancreatin cố định trên cytochrom. Phòng nghiên cứu công nghệ bức xạ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt có nhiều công trình nghiên cứu enzyme cố định trên tế bào vi sinh và các chất có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật bức xạ như cố định glucoamylase, protease, vi khuẩn tả (Vibrio Cholerae), tế bào nấm men (Saccharomyces Serevisae), vi khuẩn xử lý nước thải (Pseudomonas Maltophila) và progesteron trên các giá thể polymer tổng hợp.
Nghiên cứu của Nguyễn Anh Dũng tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 1999 ứng dụng kỹ thuật bức xạ theo 2 hướng chính là : chế tạo vật kiệu tương hợp sinh học và cố định các chất có hoạt chất sinh học lên các vật liệu polymer ghép bằng bức xạ. Sau đó đến năm 1953, Grubhofer và Schleith cố định carboxipeptidase, pepsin, ribonuclease bằng liên kết cộng hóa trị trên nhựa polyaminostyren được diazo hóa. Vào năm 1964, Richard lần đầu tiên dùng glutaraldehyde 1% để điều chế ra carboxypeptidase axit amin ở dạng tinh thể không tan, sau khixử lý enzyme vẫn không thay đổi hình dạng và giữ được 30% hoạt độ ban đầu.
Năm 1970, Mosbach đã cố định 3 loại enzyme : galactosidase, hexokinase và gluco 6 phosphate dehydrogenase được gắn bằng liên kết đồng hóa trị lên hạt sephadex và hiệu quả của phản ứng được xúc tác bởi enzyme liên kết là cao hơn nhiều. Năm 1971, người ta đã thành công trong việc dùng chymotrypsin liên kết đồng hóa trị với các carboximethyl cellulose để làm đông tụ sửa thay cho renin ủaột tieàn. Năm 1974, Ichiro Chibata và 1976 Koro Yamoto lần đầu tiên thành công trong việc sản xuất enzyme cố định đem ứng dụng trong sản xuất công nghiệp, tạo ra sản xuất là L– malic và acid fumaric người ta dùng vật liệu cố định là polyacryllamide và carrageenan được hoạt hóa bởi glutaraldehyde và hexamethyl enediamine để cố định tế bào vi sinh.
Từ đó mở ra một hướng mới trong việc sử dụng tế bào vi sinh vật và cao hơn nữa là cơ quan của thực vật, động vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và có giá trị kinh tế hơn.
GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE
Năm 1978 Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố định tế bào vi sinh Artbrobacter simplex bằng gel calcium alginate. Flavum cố định trên carrageenan để thực hiện phản ứng chuyển từ L– fumaric tạo ra sản phẩm L – malic với hiệu suất thu sản phẩm cao hơn. Ngày nay, những enzyme đắt tiền đang được chú ý đặc biệt để nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong sản xuất công nghiệp với dạng enzyme cố định.
Và Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1956). Ca còn có tác dụng đảm bảo cho amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein. Người ta cho rằng đặc tính này của amylase có liên quan đến hàm lượng của Ca trong phân tử của nó ( amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa Ca nhiều hơn amylase của nấm mốc 3 4 lần nên nó bền nhiệt hơn).
Ở pH <4,0 amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn (Virits, 1971) amylase của nấm sợi rất nhạy với nhiệt (nhiệt độ tối thích 500C) Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 600C, amylase của vi khuẩn có độ bền cao hơn cả. Termanyl là chế phẩm enzyme dạng nước chứa amylase chịu được nhiệt độ cao và được sản xuất bởi chủng men Bacillus Licheniformis (enzyme này là một amylase thủy phân liên kết) 1.4 glucosidic thành amylose và amylosepectin. Trong kỹ nghệ tinh bột : Termamyl được dùng cho việc dịch hóa liên tục tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ từ 105.
Ngoài ra hoạt tính của enzyme cũng có thể biểu thị bằng tốc độ gia tăng ban đầu của DE (đương lượng Dextrose) với nồng độ enzyme đã cho sẳn.
