BÁO cáo THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN tử bài 4 ĐỊNH TÍNH BỆNH đốm TRẮNG và BỆNH còi TRÊN tôm BẰNG bộ KIT SHPT

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO THÍ NGHIỆM GENOMIC PHÂN TỬ BÀI 4: ĐỊNH TÍNH BỆNH ĐỐM TRẮNG VÀ BỆNH CỊI TRÊN TƠM BẰNG BỘ KIT SHPT Người hướng dẫn: TS PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: NGUYỄN HƯƠNG TRÀ - 61503034 THÁI NHẬT ANH - 61800913 ĐỖ THỊ BÍCH NHIÊN - 61800979 VÕ KHÁNH ÂN - 61800912 HUỲNH THỊ MINH THƯ – 61800999 Nhóm : THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 C7-N2 MỤC LỤC I Tổng quan: 1.1 Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus): 1.2 Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus): 1.3 Phương pháp Mutiplex PCR .1 II Vật liệu, phương pháp: 2.1 Thiết bị 2.2 Hoá chất 2.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn: 2.2.2 Bộ Kit PCR 2.2.3 Bộ Kit điện di 2.3 Phương pháp: 2.3.1 Thu bảo quản mẫu: .3 2.3.2 Tách chiết DNA 2.3.3 Thực phản ứng PCR 2.3.4 Chạy điện di kết III Kết biện luận: 3.1 Kết chạy điện di 3.2 Biện luận, kiến nghị I Tổng quan: I.1 Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus): Virus đốm trắng (WSSV) tác nhân gây bệnh đốm trắng tôm nước mặn tôm nước Tôm bị bệnh đốm trắng (WSSV) thường có triệu chứng ban đầu bơi mặt nước, tập trung thành đàn quanh bờ ao chết hàng loạt vịng từ -7 ngày sau với dấu hiệu thể đốm trắng, rụng râu, thân có màu đỏ ruột trống rỗng I.2 Bệnh còi MBV( Monodon Baculo Virus): Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) virus type A Baculovirus monodon, cấu trúc nhân (acid nucleoic) ds ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que Khi tơm nhiễm virus MBV, dấu hiệu bệnh không biểu rõ rμng Khi tôm nhiễm bệnh nặng phát bệnh thường có biểu số dấu hiệu sau: - Tơm có màu tối xanh tái, xanh xẫm Tôm ăn, hoạt động yếu sinh trưởng chậm (chậm lớn) - Các phần phụ vỏ kitin có tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám (ký sinh trùng đơn bào, tảo bám vi khuẩn dạng sợi) - Gan tuỵ teo lại có mμu trắng vùng, thối nhanh - Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% tôm chết hầu hết ao I.3 Phương pháp Mutiplex PCR Multiplex PCR phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự ADN phản ứng PCR Trong trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự khuếch đại lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất thành phần bổ sung vào ống phản ứng Như phương pháp cải tiến phản ứng PCR thông thường, phương pháp giúp rút ngắn thời gian thực mà lại không ảnh hưởng tới kết thí nghiệm II Vật liệu, phương pháp: II.1Thiết bị - Máy vortex - Máy ly tâm eppendorf - Máy PCR - Máy điện di + đèn UV - Bộ kit định tính bệnh trên Tôm - Bể điều nhiệt - Erlen 250ml (dùng để tăng sinh mẫu) - Becher 100ml - Micropipette 100-1000μl, 10-100μl, 0.5-10μl - Eppendorf 1,5 ml – hấp khử trùng - Eppendorf 0,2 ml – hấp khử trùng - Đầu tip (trắng, vàng, xanh) – hấp khử trùng II.2Hoá chất II.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn:  Solution 1: Dung dịch ly trích Alkaline I: - 50 mM Glucose: trì độ thẩm thấu - 25 mM Tris-HCl (pH 8): Làm thành tế bào vi khuẩn yếu - 10 mM EDTA (pH 8): Ức chế DNAses - 100 μg/ml RNase A: Phân hủy RNA  Solution 2: Binding buffer : Gel solubilization buffer: - M Guanidine Thiocyante - 50 mM Tris-HCl - pH 7,5 20 mM - EDTA pH 8,0  Solution 3: Washing buffer - 100 mM NaCl - mM EDTA pH 8,0 - 10 mM Tris-HCl pH 8.0 50% Ethanol   - Rửa tạp chất trình tinh DNA từ gel agarose Solution 4: Elution buffer: TE (pH 8) 10 mM Tris–HCl mM EDTA Hòa tan bảo vệ DNA RNA khỏi phân cắt Ethanol 70% II.2.2 Bộ Kit PCR E.coli PCR mix Chứng dương E.coli Chứng âm II.2.3 Bộ Kit điện di Thang DNA 100bp: 6X GelRed Loading Buffer Tae 50X Agarose: - II.3Phương pháp: II.3.1 Thu bảo quản mẫu: Đối với tôm thương phẩm: lấy mang, chân bơi, gan tuỵ, bao tử, đường ruột - (lượng mẫu không 0.5g) Đối với tôm bố mẹ: lấy mẫu phân phần gốc chân bơi (lượng mẫu - không 0.5g) Mẫu phải lấy tơm cịn sống bảo quản cồn 96% - chưa tách chiết Thế tichs cồn lần thể tích mẫu Sau cố định, mẫu giữ nhiêtj độ - -20 - II.3.2 Tách chiết DNA Cân lượng mẫu không 0.5g cho vào tube 1.5mL Thêm vào 250 L - Solution Nghiền mẫu thịt chày nghiền mẫu Cho thêm 250L Solution vào, tiếp tục nghiền đến mẫu đồng hoàn - toàn Thêm 500L Solution 3( bổ sung Ethanol), vortex 4 - Ly tâm tốc độ 8000rpm phút chuyển 500L dịch sang cột silica đặt sẵn tube 2mL Ly tâm tốc độ 8000 rpm phút Giữ lại - cột loại bỏ phần chất lỏng bên Đặt lại cột vào tube 2mL cũ Rửa với 500L Solution ly tâm tốc độ - 8000rpm phút Giữ lại cột loại bỏ phần chất lỏng bên Chú ý: Rửa thêm lần để tăng độ tinh Làm khô cột ly tâm 8000rpm phút Chuyển cột sang tube 1.5mL Thêm 50L Solution ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm tốc độ 8000rpm phút, thu phần dịch chứa DNA bên - Lưu trữ -20°C II.3.3 Thực phản ứng PCR Rã đơng ống WSSV/MBV PCR Mix, trộn đều, sau spindown để toàn chất lỏng xuống đáy - Hút mẫu:  Mẫu 1: Chứng dương PCR : Hút 20L PCR mix + 5L chứng dương E.coli  Mẫu 2: Chứng âm PCR: Hút 20L PCR mix + 5L nước cất PCR  Mẫu 3: Chứng âm tách chiết: Hút 20L PCR mix + 5L chứng âm tách chiết  Mẫu 4: PCR mẫu: Hút 20L PCR mix +5L DNA mẫu - Đóng nắp PCR spindown để chất lỏng di chuyển xuống đáy trước đặt - vào máy Set chu trình nhiệt: chu kỳ - 95 oC – phút 45 chu kỳ - 95 oC – 10 phút 60 oC - 20 giây 72 oC - 40 giây chu kỳ - 72 oC - phút -4 – vô cực II.3.4 Chạy điện di kết Bảng 1: Pha DNA ladder Nồng độ mẹ Nồng độ V hút 2L 2L 2L 6L 1L 1L Nước cất To 6L 3L Total 6L 6L DNA ladder Gel Red loading dye Bảng 2: Pha mẫu chạy điện di Gel Red loading V hút dye Chứng âm PCR 10L 2L 10L 2L 10L 2L 10L 2L Chứng âm tách chiết PCR mẫu Chứng dương PCR III      - Kết biện luận: III.1 Kết chạy điện di M(Marker): Ladder (5 µL) dài 1000 bp Lane 1:Chứng âm tách chiết ( 7µL) Lane 2:Chứng âm PCR (7 µL) Lane 3:Mẫu (7 µL) Lane 4:Chứng dương (1 µL) III.2 Biện luận, kiến nghị III.2.1 Biện luận kết quả: Kết dự kiến: + Mẫu dương tính với WSSV: xuất băng kích thước 526bp (giữa vạch 500bp 600bp), nằm + Mẫu dương tính với MBV: xuất băng với kích thước 200bp (giữa vạch 100 200) + Chứng nội xuất băng với kích thước 102bp + Vạch mờ phía vạch 100bp vạch mồi cịn thừa lại sau phản ứng + Trong chứng dương bao gồm sẵn DNA tôm, MSSV MBV STT WSSV MBV IC Kết luận (526bp) (200bp) (102bp) + + -/+ Mẫu dương tính WSSV/ MBV + - + Mẫu dương tính WSSV - + + Mẫu dương tính MBV - - + Mẫu âm tính - - - Không thể kết luận - Kết dựa vào chạy điện di + Chứng âm PCR, chứng âm tách chiết, mẫu chứng dương xuất vạch 102bp – có chứng nội + Mẫu khơng có vạch 526bp 200bp  Kết luận: mẫu âm tính với WSSV/ MBV III.2.2 Sự cố xảy cách khắc phục Sự cố Nguyên nhân Khắc phục Không xuất vạch Cài đặt sai chương trình Kiểm tra lại chương trình tất giếng, kể PCR chứng dương Thiết bị PCR gặp cố Hố chất kit khơng chạy PCR Kiểm tra lại hoạt động thiết bị PCR bảo quản Kiểm tra lại điều kiện định bảo quản hạn chế sử dụng kit Chứng dương bình Hàm lượng DNA thu Pha lỗng 10 lần dịch thường mẫu xét nghiệm cao không cho vạch DNA, kể DNA thực lại 10 vạch chứng nội Có chất ức chế mẫu phản ứng PCR Bổ sung lượng nhỏ chứng dương mục tiêu vào mẫu tách chiết Nếu kết âm tính kết luận có chất ức chế mẫu Tiến hành tách chiết lại xử lý cách Xuất vạch DNA Micropippet bị nhiễm Vệ sinh chứng âm, chứng DNA mục tiêu sản Micropippet âm tách chiết phẩm PCR mới, thay sử dụng filter tip Mơi trường lồm việc bị Sử dụng hoá chất PCR nhiễm DNA khác Yêu cầu phận kĩ thuật đến vệ sinh môi trường làm việc 11 ... Bệnh đốm trắng WSSV(White Spot Syndrome Virus): Virus đốm trắng (WSSV) tác nhân gây bệnh đốm trắng tôm nước mặn tôm nước Tơm bị bệnh đốm trắng (WSSV) thường có triệu chứng ban đầu bơi mặt nước,... 2.1 Thiết bị 2.2 Hoá chất 2.2.1 Bộ Kit tách chiết genome vi khuẩn: 2.2.2 Bộ Kit PCR 2.2.3 Bộ Kit điện di 2.3 Phương pháp: 2.3.1 Thu... Solution 4: Elution buffer: TE (pH 8) 10 mM Tris–HCl mM EDTA Hòa tan bảo vệ DNA RNA khỏi phân cắt Ethanol 70% II.2.2 Bộ Kit PCR E.coli PCR mix Chứng dương E.coli Chứng âm II.2.3 Bộ Kit điện di