Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase hTERT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ………………… Hoàng Thị Ngà NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE (hTERT) LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội, 2013 Hoàng Thị Ngà NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE (hTERT) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÃ THỊ HUYỀN PGS TS NGUYỄN QUANG HUY LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin gửi lời cảm cám ơn chân thành sâu sắc đến TS Lã Thị Huyền, PGS TS Nguyễn Quang Huy tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn, Trƣởng phịng Phịng Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện suốt trình nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS Lê Thị Thùy Dƣơng, NCS Lê Thị Hạnh, CN Phạm Văn Phúc anh chị phịng Cơng nghệ tế bào động vật giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện tốt trình học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo, cô giáo dạy Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội dạy bảo giúp đỡ thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè ln động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm 2013 Học viên Hoàng Thị Ngà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu telomerase reverse transcriptase .3 1.1.1 Giới thiệu chung telomere người 1.1.2 Hoạt động telomerase người 1.1.3 Tình hình nghiên cứu hTERT 1.1.4 Vacxin DNA triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT 1.2 Tổng quan chitosan 11 1.2.1 Giới thiệu chung chitosan 11 1.2.2 Ứng dụng chitosan 13 1.2.3 Giới thiệu chung nano chitosan 14 1.2.4 Chitosan, chất mang dẫn truyền gen 16 1.2.5 Các phương pháp tạo nano chitosan 16 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Vật liệu hóa chất 22 2.1.2 Thiết bị 22 2.1.3 Môi trường dung dịch 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) 24 2.2.2 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 25 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 26 2.2.4 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose 26 2.2.5 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli 27 MỤC LỤC 2.2.6 Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) tích hợp gen mã hóa hTERT 28 2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn .28 2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide DNA 29 2.2.9 Phương pháp tạo hạt nano chitosan 29 2.2.10 Phương pháp tạo phức hệ nao chitosan/vector mang hTERT 31 2.2.11 Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) 31 2.2.12 Phương pháp đo size, phân bố size zeta 32 2.2.13 Phương pháp xác định hiệu đóng gói 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Thiết kế vector pcDNA3.1(+) mang đoạn gen mã hóa cho epitope telomerase reverse transcriptase (hTERT) 37 3.1.1 Tổng hợp đoạn gen hTERT 37 3.1.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI XbaI 37 3.1.3 Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT 39 3.1.4 Xác định trình tự đoạn gen hTERT plasmid tái tổ hợp 41 3.2 Kết tạo hạt nano chitosan 42 3.2.1 Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình 42 3.2.2 Tạo hạt nano chitosan/TPP 43 3.3 Kết tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT 47 3.3.1 Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3.1/hTERT 47 3.3.2 Đánh giá khả mang DNA hạt nano chitosan 50 KẾT LUẬN 53 MỤC LỤC KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt viết tắt APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên bp Base pair Cặp base Chi Chitosan Chitosan Cs Cộng CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào lympho T gây độc DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic EDTA Ethyenediaminetetraacetic acid Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli hTR Human temlate for replication hTERT Human telomerase reverse transcriptase TCR T-cell receptor MHC Major Thụ thể tế bào T histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức complex HLA Human leucocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu ngƣời SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét PDI polydispersity index Chỉ số phân tán TPP Tripolyphosphate kb Kilo base LB Luria Bertani Môi trƣờng LB RNase Ribonuclease Enzyme phân hủy RNA v/ph Vòng/phút DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể khác Hình 1.2 Phức hợp protein cấu trúc T-loop telomere Hình 1.3 Tổ chức gen hTERT Hình 1.4 Cơ chế vacxin DNA .10 Hình 1.5 Cấu trúc chitin chitosan 12 Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng .17 Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp giọt tụ 18 Hình 1.8 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp hợp giọt nhũ tƣơng 19 Hình 1.9 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp mixen đảo 20 Hình 1.10 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp tạo gel ion .21 Hình 2.1 Kính hiển vi điện tử quét S-4800 (FE-SEM, Hitachi) 32 Hình 2.2 Bề mặt hạt nano mang điện tích zeta 34 Hình 2.3 Sự biến thiên zeta theo giá trị pH môi trƣờng .35 Hình 3.1 Sơ đồ đoạn gen hTERT 37 Hình 3.2 Sơ đồ vector pcDNA3.1(+) 38 Hình 3.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 40 Hình 3.4 Điện đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme EcoRI 41 Hình 3.5 Trình tự nucleotide trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng đoạn gen mã hóa hTERT 42 Hình 3.6 Cơ chế tƣơng tác chitosan TPP 44 Hình 3.7 Kích thƣớc hạt nano chitosan/TPP 45 Hình 3.8 Thế zeta hạt nano chitosan/TPP .46 Hình 3.9 Kích thƣớc hạt nano chitosan-plasmid DNA 47 Hình 3.10 Thế zeta hạt nano chitosan/plasmid DNA .48 Hình 3.11 Ảnh SEM nano chitosan –plasmid DNA .49 Hình 3.12 Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA 50 Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA cắt DNaseI 51 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa hTERT vào vector pcDNA3.1(+) 24 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+) enzyme BamHI XbaI 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+)/hTERT EcoRI 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plamid DNA enzyme DNase I .25 Bảng 2.6 Sự phụ thuộc độ ổn định hệ keo vào giá trị Zeta .34 Luận văn thạc sỹ khoa học MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ung thƣ bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao số ngƣời mắc bệnh ngày tăng Mặc dù cộng đồng y sinh nỗ lực nhƣng ung thƣ nguyên nhân hàng đầu dẫn đến chết, đau khổ bệnh tật Hầu hết bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hóa trị Các phƣơng pháp ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u ngun phát Bên cạnh đó, phƣơng pháp khơng đặc hiệu thƣờng gây tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho thể ngƣời bệnh, phá hủy mô khỏe mạnh Với hy vọng khắc phục trở ngại trên, nhiều nhà khoa học tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại bệnh ung thƣ Một liệu pháp sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp lợi khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thơng thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, tiềm bền điều trị thông qua nhớ miễn dịch, Với phát triển công nghệ nano, vaccine dạng nano đƣợc nghiên cứu Các vaccine dạng thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao Telomerase enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho chép telomere đầu cuối nhiễm sắc thể hầu hết sinh vật nhân chuẩn Telomerase ngƣời phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR hTERT hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) RNA làm khuôn để chép, hTERT (human telomerase reverse transcriptase) enzyme phiên mã ngƣợc Chúng hoạt động tế bào mầm tế bào ung thƣ, không hoạt động hoạt động thấp tế bào soma Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT mang lại nhiều triển vọng ứng dụng điều trị ung thƣ Hiện giới có nhiều nghiên cứu epitope hTERT nhận thấy chúng có đáp ứng miễn dịch tốt với hầu hết tế bào ung thƣ Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 10 DNase I Hạt nano chitosan/plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT cắt Hạt nano chitosan/plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT Từ kết thấy thời gian định plasmid tự dung dịch bị cắt, DNA plasmid phức hệ nano chitosan đƣợc bảo vệ khỏi phân hủy DNaseI Điều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trƣớc Wei Xu cs (2004) Các hạt nano chitosan tích điện dƣơng, có khả liên kết bảo vệ DNA khỏi phân hủy DNase I Từ kết khẳng định tạo thành công phức hợp nano chitosan mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT có khả dẫn truyền DNA bảo vệ DNA KẾT LUẬN Đã chọn dịng thành cơng vector biểu tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa epitope GV1001 kháng nguyên hTERT Bằng phƣơng pháp gel ion tạo thành cơng đƣợc hạt nano chitosan/TPP, kích thƣớc hạt nhỏ 100 nm ổn định đảm bảo cho việc tạo phức với plasmid DNA Tạo thành công phức hệ nano chitosan mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT chứa đoạn gen mã hóa epitope kháng ngun hTERT Các hạt nano chitosan/plasmid DNA có kích thƣớc 114,7 nm zeta 18,8 mV Phức hệ nano chitosan/plamid DNA có khả bảo vệ DNA khỏi DNaseI Hiệu suất mang plasmid DNA hạt nano chitosan tạo 57 % KIẾN NGHỊ Nghiên cứu khả biểu đoạn gen hTERT vector tái tổ hợp tế bào động vật Kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch phức hệ nano chitosan/plasmid DNA động vật thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Anh Dũng (2008), "Nghiên cứu chế tạo hạt nano-chitosan làm chất mang kích thích đáp ứng miễn dịch cho vaccine cúm H5N1", Báo cáo đề tài thành phố HCM, Trần Đại Lâm c s (2010), "Một số ứng dụng y sinh môi trƣờng chitosan", Hội nghị khoa học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 168172 Trần Thị Luyến (2006), "Nghiên cứu sử dụng oligoglucosamin từ chitosan để giữ tƣơi thịt heo", Tạp chí khoa học phát triển, Nguyễn Thị Bích Thúy N T T N., Đỗ Thị Thu Thủy (2008), "Ảnh hƣởng nồng độ chitosan đến chất lƣợng thời gian bảo quản chanh", Tạp chí khoa học phát triển, Tập VI(1), 70-75 Dƣơng Thị Ánh Tuyết (2010), Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng dẫn truyền thuốc, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một TIẾNG ANH Ada G (2005), "Overview of vaccines and vaccination ", Mol Biotechnol, 29(3), 255-272 Agnihotri S A., Mallikarjuna N N., Aminabhavi T M (2004), "Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery", J Control Release, 100(1), 5-28 Arai J., Yasukawa M., Ohminami H., Kakimoto M., Hasegawa A., Fujita S (2001), "Identification of human telomerase reverse transcriptase-derived peptides that induce HLA-A24-restricted antileukemia cytotoxic T lymphocytes", Blood, 97(9), 2903-2907 Bailey S E O., T.J.; Bricka, R.M and Adrian, D.D (1999), "A review of potentially low-cost sorbent for heavy metals", Water Research, 33(11), 2469-2479 10.Bernhardt S L., Gjertsen M K., Trachsel S., Moller M., Eriksen J A., Meo M., Buanes T., Gaudernack G (2006), "Telomerase peptide vaccination of patients with non-resectable pancreatic cancer: A dose escalating phase I/II study", Br J Cancer, 95(11), 1474-1482 11.Bodnar A G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S E., Chiu C P., Morin G B., Harley C B., Shay J W., Lichtsteiner S., Wright W E (1998), "Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells", Science, 279(5349), 349- 352 12.Bozkir A., Saka O M (2004), "Chitosan nanoparticles for plasmid DNA delivery: effect of chitosan molecular structure on formulation and release characteristics", Drug Deliv, 11(2), 107-112 13.Brine C J., Stanford, P.A, Zikalis, J.P, (1992), "Advances in chitin and chitosan", 14.Broberg K., Bjork J., Paulsson K., Hoglund M., Albin M (2005), "Constitutional short telomeres are strong genetic susceptibility markers for bladder cancer", Carcinogenesis, 26(7), 1263-1271 15.Brunsvig P F., Aamdal S., Gjertsen M K., Kvalheim G., MarkowskiGrimsrud C J., Sve I., Dyrhaug M., Trachsel S., Moller M., Eriksen J A., Gaudernack G (2006), "Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer", Cancer Immunol Immunother, 55(12), 1553-1564 16.Calvo P., J L Vila-Jato, and M J Alonson (1997), "Novel hydrophilic chitosan-polyethylene oxide nanoparticles as protein carrier", J Appl Poly Sci, 63(125-132 17.Capezzone M., Cantara S., Marchisotta S., Filetti S., De Santi M M., Rossi B., Ronga G., Durante C., Pacini F (2008), "Short telomeres, telomerase reverse transcriptase gene amplification, and increased telomerase activity in the blood of familial papillary thyroid cancer patients", J Clin Endocrinol Metab, 93(10), 3950-3957 18.Carrero-Gomez B A D., R., (1997), "Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres", Int J Pharm, 148(131-140 19.Cattamanchi A., Posavad C M., Wald A., Baine Y., Moses J., Higgins T J., Ginsberg R., Ciccarelli R., Corey L., Koelle D M (2008), "Phase I study of a herpes simplex virus type (HSV-2) DNA vaccine administered to healthy, HSV-2-seronegative adults by a needle-free injection system", Clin Vaccine Immunol, 15(11), 1638-1643 20.Cesare A J., Reddel R R (2008), "Telomere uncapping and alternative lengthening of telomeres", Mech Ageing Dev, 129(1-2), 99-108 21.Cheba B A (2011), "Chitin and chitosan: Marine Biopolymers with Unique Properties and Versatide Applications", Global Joumal of Biotechnology & Biochemistry, 6(3), 149-153 22.Chow KS K E., Wan ACA (2001), "Porous chitin matrices for tissue engineering: fabrication and in - vitro cytotoxic assessment", J Polym Res, 8(27-35 23.Cong Y S., Wright W E., Shay J W (2002), "Human telomerase and its regulation", Microbiol Mol Biol Rev, 66(3), 407-425, table of contents 24.Dastan T a K T (2004), "In vitro characterization and delivery of chitosanDNA microparticles into mammalian cells", J Pharm Pharm Sci, 7(2), 205214 25.Davis H L (1997), "Plasmid DNA expression systems for the purpose of immunization", Curr Opin Biotechnol, 8(5), 635-646 26.de Lange T (2004), "T-loops and the origin of telomeres", Nat Rev Mol Cell Biol, 5(4), 323-329 27.de Lange T (2002), "Protection of mammalian telomeres", Oncogene, 21(4), 532-540 28.Erbacher P., Zou S., Bettinger T., Steffan A M., Remy J S (1998), "Chitosan- based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability", Pharm Res, 15(9), 1332-1339 29.Faurez F., Dory D., Le Moigne V., Gravier R., Jestin A (2010), "Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection", Vaccine, 28(23), 3888-3895 30.Feng J., Funk W D., Wang S S., Weinrich S L., Avilion A A., Chiu C P., Adams R R., Chang E., Allsopp R C., Yu J., et al (1995), "The RNA component of human telomerase", Science, 269(5228), 1236-1241 31.Filaci G., Fravega M., Setti M., Traverso P., Millo E., Fenoglio D., Negrini S., Ferrera F., Romagnoli A., Basso M., Contini P., Rizzi M., Ghio M., Benatti U., Damonte G., Ravetti J L., Carmignani G., Zanetti M., Indiveri F (2006), "Frequency of telomerase-specific CD8+ T lymphocytes in patients with cancer", Blood, 107(4), 1505-1512 32.Gan Q., Wang T (2007), "Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier-systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release", Colloids Surf B Biointerfaces, 59(1), 24-34 33.Greider C W (1994), "Mammalian telomere dynamics: healing, fragmentation shortening and stabilization ", Curr Opin Genet Dev, 4(2), 203-211 34.Gryaznov S M., Jackson S., Dikmen G., Harley C., Herbert B S., Wright W E., Shay J W (2007), "Oligonucleotide conjugate GRN163L targeting human telomerase as potential anticancer and antimetastatic agent", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 26(10-12), 1577-1579 35.Gurunathan S., Klinman D M., Seder R A (2000), "DNA vaccines: immunology, application, and optimization*", Annu Rev Immunol, 18(927974 36.Hahn W C., Stewart S A., Brooks M W., York S G., Eaton E., Kurachi A., Beijersbergen R L., Knoll J H., Meyerson M., Weinberg R A (1999), "Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells", Nat Med, 5(10), 1164-1170 37.Harley C B., Futcher A B., Greider C W (1990), "Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts", Nature, 345(6274), 458-460 38.Hathcock K S., Hemann M T., Opperman K K., Strong M A., Greider C W., Hodes R J (2002), "Haploinsufficiency of mTR results in defects in telomere elongation", Proc Natl Acad Sci U S A, 99(6), 3591-3596 39.Herbert B., Pitts A E., Baker S I., Hamilton S E., Wright W E., Shay J W., Corey D R (1999), "Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death", Proc Natl Acad Sci U S A, 96(25), 14276-14281 40.Hochreiter A E., Xiao H., Goldblatt E M., Gryaznov S M., Miller K D., Badve S., Sledge G W., Herbert B S (2006), "Telomerase template antagonist GRN163L disrupts telomere maintenance, tumor growth, and metastasis of breast cancer", Clin Cancer Res, 12(10), 3184-3192 41.Ingolotti M., Kawalekar O., Shedlock D J., Muthumani K., Weiner D B (2010), "DNA vaccines for targeting bacterial infections", Expert Rev Vaccines, 9(7), 747-763 42.Jang J S., Choi Y Y., Lee W K., Choi J E., Cha S I., Kim Y J., Kim C H., Kam S., Jung T H., Park J Y (2008), "Telomere length and the risk of lung cancer", Cancer Sci, 99(7), 1385-1389 43.Joseph I., Tressler R., Bassett E., Harley C., Buseman C M., Pattamatta P., Wright W E., Shay J W., Go N F (2010), "The telomerase inhibitor imetelstat depletes cancer stem cells in breast and pancreatic cancer cell lines", Cancer Res, 70(22), 9494-9504 44.Kaats G R., Michalek J E., Preuss H G (2006), "Evaluating efficacy of a chitosan product using a double-blinded, placebo-controlled protocol", J Am Coll Nutr, 25(5), 389-394 45.Khor E., Lim L Y (2003), "Implantable applications of chitin and chitosan", Biomaterials, 24(13), 2339-2349 46.Kim N W (1997), "Clinical implications of telomerase in cancer", Eur J Cancer, 33(5), 781-786 47.Kim N W., Piatyszek M A., Prowse K R., Harley C B., West M D., Ho P L., Coviello G M., Wright W E., Weinrich S L., Shay J W (1994), "Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer", Science, 266(5193), 2011-2015 48.Kipling D (1997), "Telomere structure and telomerase expression during mouse development and tumorigenesis", Eur J Cancer, 33(5), 792-800 49.Koping-Hoggard M., Tubulekas I., Guan H., Edwards K., Nilsson M., Varum K M., Artursson P (2001), "Chitosan as a nonviral gene delivery system Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo", Gene Ther, 8(14), 1108-1121 50.Kutzler M A., Weiner D B (2008), "DNA vaccines: ready for prime time?" Nat Rev Genet, 9(10), 776-788 51.Kyte J A (2009), "Cancer vaccination with telomerase peptide GV1001", Expert Opin Investig Drugs, 18(5), 687-694 52.L Qui Z X., X Jiang, C Hu and X Zou (2004), "Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticle", Carbohydrate Reseach, 339(2693-2700 53.Lansdorp P M., Verwoerd N P., van de Rijke F M., Dragowska V., Little M T., Dirks R W., Raap A K., Tanke H J (1996), "Heterogeneity in telomere length of human chromosomes", Hum Mol Genet, 5(5), 685-691 54.Lee V F (1974), "Solution and shear properties of chitin and chitosan Ph.D.Dissertation, university of Washington, university microfilms", Ann Arbor, MI, USA, Microfilm, 446(74-29 55.Leong K W., Mao H Q., Truong-Le V L., Roy K., Walsh S M., August J T (1998), "DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles", J Control Release, 53(1-3), 183-193 56.Liu D., Safari A., O'Connor M S., Chan D W., Laegeler A., Qin J., Songyang Z (2004), "PTOP interacts with POT1 and regulates its localization to telomeres", Nat Cell Biol, 6(7), 673-680 57.Mao H Q., Roy K., Troung-Le V L., Janes K A., Lin K Y., Wang Y., August J T., Leong K W (2001), "Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency", J Control Release, 70(3), 399-421 58.Martens U M., Zijlmans J M., Poon S S., Dragowska W., Yui J., Chavez E A., Ward R K., Lansdorp P M (1998), "Short telomeres on human chromosome 17p", Nat Genet, 18(1), 76-80 59.Meyerson M., Counter C M., Eaton E N., Ellisen L W., Steiner P., Caddle S D., Ziaugra L., Beijersbergen R L., Davidoff M J., Liu Q., Bacchetti S., Haber D A., Weinberg R A (1997), "hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization", Cell, 90(4), 785-795 60.Mirabello L., Garcia-Closas M., Cawthon R., Lissowska J., Brinton L A., Peplonska B., Sherman M E., Savage S A (2010), "Leukocyte telomere length in a population-based case-control study of ovarian cancer: a pilot study", Cancer Causes Control, 21(1), 77-82 61.Moghaddam F A., Atyabi F., Dinarvand R (2009), "Preparation and in vitro evaluation of mucoadhesion and permeation enhancement of thiolated chitosan-pHEMA core-shell nanoparticles", Nanomedicine, 5(2), 208-215 62.Muzzarelli R A (1997), "Human enzymatic activities related to the therapeutic administration of chitin derivatives", Cell Mol Life Sci, 53(2), 131-140 63.Nakamura T M., Morin G B., Chapman K B., Weinrich S L., Andrews W H., Lingner J., Harley C B., Cech T R (1997), "Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human", Science, 277(5328), 955959 64.Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi T., Tahara E., Ide T., Ishikawa F (1998), "Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas", Nat Genet, 18(1), 65-68 65.Nguyen Anh Dung N T N H., Dang Thi Hong Van, Nguyen Thi Lan Phuong, Nguyen Thi Nhu Quynh, Dinh Minh Hiep, Le Van Hiep (2011), "Chitosan nanoparticle as a novel delivery system for A/H1N1 influenze vaccine: safe property and immunogenicity in mice", World Academy of Science, Engineering and Technology, 5(12), 1300-1308 66.No H K., Park N Y., Lee S H., Meyers S P (2002), "Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights", Int J Food Microbiol, 74(1-2), 65-72 67.Okamoto Y., Watanabe M., Miyatake K., Morimoto M., Shigemasa Y., Minami S (2002), "Effects of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migrations of fibroblasts and vascular endothelium", Biomaterials, 23(9), 1975-1979 68.Park I K., Park Y H., Shin B A., Choi E S., Kim Y R., Akaike T., Cho C S (2000), "Galactosylated chitosan-graft-dextran as hepatocyte-targeting DNA carrier", J Control Release, 69(1), 97-108 69.Pascual E., Julia M R (2001), "The role of chitosan in wool finishing", J Biotechnol, 89(2-3), 289-296 70.Purbhoo M A., Li Y., Sutton D H., Brewer J E., Gostick E., Bossi G., Laugel B., Moysey R., Baston E., Liddy N., Cameron B., Bennett A D., Ashfield R., Milicic A., Price D A., Classon B J., Sewell A K., Jakobsen B K (2007), "The HLA A*0201-restricted hTERT(540-548) peptide is not detected on tumor cells by a CTL clone or a high-affinity T-cell receptor", Mol Cancer Ther, 6(7), 2081-2091 71.Reyes-Sandoval A., Ertl H C (2001), "DNA vaccines", Curr Mol Med, 1(2), 217-243 72.Richardson S., Kolbe, H.V.J and Ducan, R., (1997), "Evaluation of highly purified chitosan as a potential gene delivery vector", Proceed Int Symp Contr Rel Bioact Mater, 24(649-650 73.Risques R A., Vaughan T L., Li X., Odze R D., Blount P L., Ayub K., Gallaher J L., Reid B J., Rabinovitch P S (2007), "Leukocyte telomere length predicts cancer risk in Barrett's esophagus", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 16(12), 2649-2655 74.Roberts G A F (1992), "Solubilitity and solution behavior of chitin and chitosan", GAF Roberts,ed Chitin Chemistry MacMillan, Houndmills, 274329 75.Roy M., H.Q.Mao, and K.W Leong (1997), "DNA-chitosan nanospheres: transfection efficacy and cellular uptake", Proceed Int'l Symp Control Red Bioact Mater, 24(673-674 76.Sato T., Ishii T., Okahata Y (2001), "In vitro gene delivery mediated by chitosan effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency", Biomaterials, 22(15), 2075-2080 77.Shay J W., Bacchetti S (1997), "A survey of telomerase activity in human cancer", Eur J Cancer, 33(5), 787-791 78.Smogorzewska A., de Lange T (2004), "Regulation of telomerase by telomeric proteins", Annu Rev Biochem, 73(177-208 79.Takakura M., Kyo S., Kanaya T., Tanaka M., Inoue M (1998), "Expression of human telomerase subunits and correlation with telomerase activity in cervical cancer", Cancer Res, 58(7), 1558-1561 80.Tasker R A., Ross S J., Dohoo S E., Elson C M (1997), "Pharmacokinetics of an injectable sustained-release formulation of morphine for use in dogs", J Vet Pharmacol Ther, 20(5), 362-367 81.Tiyaboonchai W (2003), "Chitosan Nanoparticles: APromising System for Drug Delivery", Naresuan University Journal, 11(3), 51-66 82.Vonderheide R H (2008), "Prospects and challenges of building a cancer vaccine targeting telomerase", Biochimie, 90(1), 173-180 83.Vonderheide R H., Anderson K S., Hahn W C., Butler M O., Schultze J L., Nadler L M (2001), "Characterization of HLA-A3-restricted cytotoxic T lymphocytes reactive against the widely expressed tumor antigen telomerase", Clin Cancer Res, 7(11), 3343-3348 84.Vonderheide R H., Domchek S M., Schultze J L., George D J., Hoar K M., Chen D Y., Stephans K F., Masutomi K., Loda M., Xia Z., Anderson K S., Hahn W C., Nadler L M (2004), "Vaccination of cancer patients against telomerase induces functional antitumor CD8+ T lymphocytes", Clin Cancer Res, 10(3), 828-839 85.Vonderheide R H., Hahn W C., Schultze J L., Nadler L M (1999), "The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes", Immunity, 10(6), 673-679 86.W.L Du S S N., Y.L Xu, Z.R Xu, C.L Fan (2009), "Antibacterial activity of chitosan tripolyphosphate nanoparticles load with various metal ions", Carbohyddrate Polymers, 75(385-389 87.Weinrich S L., Pruzan R., Ma L., Ouellette M., Tesmer V M., Holt S E., Bodnar A G., Lichtsteiner S., Kim N W., Trager J B., Taylor R D., Carlos R., Andrews W H., Wright W E., Shay J W., Harley C B., Morin G B (1997), "Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTR and the catalytic protein subunit hTRT", Nat Genet, 17(4), 498-502 88.Wierecky J., Muller M R., Wirths S., Halder-Oehler E., Dorfel D., Schmidt S M., Hantschel M., Brugger W., Schroder S., Horger M S., Kanz L., Brossart P (2006), "Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients", Cancer Res, 66(11), 5910-5918 89.Ye J Z., Hockemeyer D., Krutchinsky A N., Loayza D., Hooper S M., Chait B T., de Lange T (2004), "POT1-interacting protein PIP1: a telomere length regulator that recruits POT1 to the TIN2/TRF1 complex", Genes Dev, 18(14), 1649-1654 90.Yoo S H., Lee J S., Park S Y., Kim Y S., Chang P S., Lee H G (2005), "Effects of selective oxidation of chitosan on physical and biological properties", Int J Biol Macromol, 35(1-2), 27-31 ...Hoàng Thị Ngà NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE (hTERT) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC... ? ?Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT) ” Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu tế bào động vật pcDNA3.1(+) /hTERT. .. pcDNA3.1(+) /hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope kháng nguyên hTERT - Tạo hạt nano chitosan/ TPP có kích thƣớc mong muốn - Tạo phức hệ nano chitosan- plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+) /hTERT Đánh giá khả mang