Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân tích một số amin thơm trong các sản phẩm da bằng phương pháp LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TẠ THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ AMIN THƠM TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 TẠ THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ AMIN THƠM TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/MS/MS CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành Luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị đồng nghiệp cơng tác Trung tâm Phân tích Cơng nghệ Môi trƣờng – Viện Nghiên cứu Da giầy tạo điều kiện tốt cho đƣợc học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giảng dạy Khoa Hóa học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tập thể lớp cao học K24 giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu trƣờng Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè – ngƣời động viên, khuyến khích cổ vũ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Tạ Thị Ngọc Ánh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thuốc nhuộm azo 1.1.1 Giới thiệu thuốc nhuộm azo 1.1.2 Sự chuyển hoá thuốc nhuộm azo thành amin thơm 1.1.3 Ảnh hưởng amin thơm giải phóng từ thuốc nhuộm azo đến sức khoẻ người 1.2 Tổng quan trạng sử dụng thuốc nhuộm azo ngành thuộc da 1.2.1 Hiện trạng sử dụng thuốc nhuộm azo giới 1.2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc nhuộm azo Việt Nam 1.3 Tổng quan phƣơng pháp phân tích amin thơm giải phóng từ thuốc nhuộm azo 11 1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 11 1.3.2 Phương pháp phân tích amin thơm giới Việt Nam 13 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 24 2.1 Hóa chất – Thiết bị 24 2.1.1 Hoá chất chuẩn 24 2.1.2 Dung mơi hố chất phụ trợ 24 2.1.3 Thiết bị phân tích 24 2.1.4 Thiết bị phụ trợ 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp kế thừa 26 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 26 2.2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu cho thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 26 2.2.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 27 2.2.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 28 2.2.2.4 So sánh phương pháp phân tích xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu cho thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 34 3.1.1 Khảo sát trình tách sắc ký 34 3.1.2 Khảo sát thông số tối ưu cho đầu dò khối phổ 38 3.1.3 Khảo sát thời gian lưu chất amin thơm 42 3.2 Khảo sát điều kiện tối ƣu cho xử lý mẫu 44 3.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu da phân tích amin thơm 44 3.2.2.Ảnh hưởng pH đến độ thu hồi phương pháp chiết lỏng lỏng .45 3.2.3 Ảnh hưởng dung môi chiết 47 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng số lần chiết 47 3.2.6 Tổng hợp quy trình xử lý mẫu phân tích amin thơm mẫu da 48 3.3 So sánh phƣơng pháp phân tích xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn (TCVN 7536: 2005 ) 54 3.4 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích nghiên cứu vào phân tích số sản phẩm da lƣu hành thị trƣờng Việt Nam 55 KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 63 PHỤ LỤC 1: KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU XÁC ĐỊNH CÁC AMIN THƠM TRÊN DETECTOR MS/MS 64 PHỤ LỤC 2: ĐƢỜNG CHUẨN XÁC ĐỊNH CÁC AMIN THƠM BẰNG HỆ THỐNG HPLC-MS/MS 83 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 18 AMIN THƠM BẰNG HỆ THỐNG HPLC – MS/MS 102 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1: Chuyển hóa amin thơm từ thuốc nhuộm azo Hình 2: Độ thu hồi phƣơng pháp xác định amin thơm từ mẫu da thật 19 Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp đầu dò khối phổ HPLC – MS/MS 25 Hình 2: Các thơng số cần tối ƣu hóa cho đầu dị khổi phổ để phân tích amin thơm 27 Hình 3: Khoảng tuyến tính phƣơng pháp phân tích 32 Hình 1: Phân tách sắc ký chất amin thơm cột Hypersil Gold C18 34 Hình 2: Phân tách sắc ký chất amin thơm cột Hypersil Gold aQ 35 Hình 3: Phân tách sắc ký chất amin thơm cột Hypersil Gold PFP 35 Hình 4: Phân tách chất amin thơm cột C18 với pha động A-H2O (0,1% FA) B-MeOH 36 Hình 5: Phân tách chất amin thơm cột C18 với pha động AH2O(CH3COONH4 25mM) B-MeOH 37 Hình 6: Phân tách chất amin thơm cột C18 với pha động A-H2O BMeOH 37 Hình 7: Tối ƣu hóa thơng số cho nguồn ion hóa ESI 39 Hình 8: Phổ khối tiêu biểu NTA quét chế độ Fullscan .40 Hình 9: Phổ khối tiêu biểu NTA chạy chế độ Fullscan – product .40 Hình 10: Tối ƣu hóa lƣợng bắn phá NTA 41 Hình 11: Ảnh hƣởng pH đến độ thu hồi (pH=8,93) 46 Hình 12: Ảnh hƣởng pH đến độ thu hồi (pH=4,13) 46 Hình 13: So sánh độ thu hồi sử dụng dung mơi chiết khác 47 Hình 14: Ảnh hƣởng số lần chiết đến độ thu hồi 48 Hình 16: Quy trình xử lý mẫu da phân tích amin thơm HPLC-MS/MS 49 Hình 15: : Quy trình xử lý mẫu da phân tích amin thơm HPLC-MS/MS 49 Hình 17: Độ chọn lọc phƣơng pháp phân tích chất TDA 50 Hình 18: Độ thu hồi phƣơng pháp chiết amin thơm .51 Hình 19: Đƣờng chuẩn ASD khoảng hàm lƣợng 1,0 – 10 mg/kg .53 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Danh sách amin thơm thuốc nhuộm bị EU cấm sử dụng [22] Bảng 2: Phân tích đánh giá phản ứng amin thơm 13 Bảng 3: Độ thu hồi trung bình amin thơm trình khử (n=3) 15 Bảng 4: Các phƣơng pháp phân tích xác định thuốc nhuộm azo bị cấm sản phẩm tiêu dùng 16 Bảng 5: Thơng số tối ƣu cho q trình phân tích MS/MS 19 Bảng 6: Đƣờng chuẩn giới hạn phát amin (trung bình lặp lại) 20 Bảng 7: Độ thu hồi hỗn hợp chuẩn amin thơm sợi khơng nhuộm (trung bình lặp lại) 21 Bảng 1: Thông số thiết lập cho HPLC/DAD 34 Bảng 2: Các thơng số thiết lập cho nguồn ion hóa ESI 39 Bảng 3: Tổng hợp mảnh phổ hợp chất amin lƣợng bắn phá tối ƣu 42 Bảng 4: Tổng hợp thời gian lƣu 21 amin thơm 43 Bảng 5: Hằng số pKa logKow amin thơm 45 Bảng 6: Độ lặp lại phƣơng pháp phân tích amin thơm da thuộc (n=6) 51 Bảng 7: Đánh giá giới hạn phát phƣơng pháp phân tích da thuộc 52 Bảng 8: Kết tính tốn độ chụm độ theo phƣơng pháp tiêu chuẩn 54 Bảng 9: Kết tính tốn độ chụm độ theo phƣơng pháp nghiên cứu .54 Bảng 10: Kết phân tích thuốc nhuộm azo mẫu da thuộc thị trƣờng 56 DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Từ viết tắt 4-Aminobiphenyl O-Anisidine Atomic Absorption Spectrophotometric Association of Official Agricultural Chemists Benzidine Bureau Veritas Quality International 4-Chloroaniline 4-Chloro-o-toluidine Comité Européen de Normalisation Consumer Product Safety Improvement Act 4-Cresidine Deutsches Institut für Normung Diode Array Detector 4,4-Diaminodiphenylmethane 3,3'-Dimethoxybenzidine 3,3-Dimetylbenzidine 3,3-Dimethyl-4,4 diaminodiphenylmethane 3,3'-Diclobenzidine 2,4-Diaminotoluen Electron Spray Ionization European Economic Community European Commission Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatography High Performance Capillary Electrophoresis Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry International Standard Organization International Union of Pure and Applied Chemistry Limit of Detector Limit of Quantitation Mass Spectrography Method Detector Limit 4,4'-Metylen-bis-(2-cloaniline) 2-Naphthylamine Organisation for Economic Co-operation and Development Tên viết tắt ABP ASD AAS AOAC BZD BVQI CAN COT CEN CPSIA CSD DIN DAD DDM DTB DBD DPM DBZ DAT ESI EEC EC GC HPLC HPCE ICP-MS ISO IUPAC LOD LOQ MS MDL MTB NTA OECD TT 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Từ viết tắt 4,4'-Oxydianiline Recovery Standard Deviation Registration Evaluation Authorization Restriction Shoe and Allied Trades Research Association Tiêu chuẩn Việt Nam Thin Layer Chromatography 4,4'-Thiodianiline o-Toluidine 2,4,5-Trimethylaniline Ultraviolet–visible spectroscop Văn phịng Cơng nhận Chất lƣợng Tên viết tắt ODA RSD REACH SATRA TCVN TCL TDA TLD TMA UV-Vis BoA STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 4,4_Thiodianiline Y = -3.97799e+006+2.25479e+006*X R^2 = 0.9975 W: 1/X 20000000 18000000 16000000 TDA 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 RT: 15.00 - 25.00 SM: mg/kg 5G 10 RT: 22.36 AA: 393163 100 80 60 mg/kg 40 RT: 24.15 AA: 557 20 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Time (min) RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.39 AA: 1803171 10 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 11 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Time (min) RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.37 AA: 6749593 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 RT: 23.81 10 RT: 24.31 AA: 1259 AA: 2177 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Time (min) RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.39 AA: 14446009 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 24.14 AA: 1054 15 16 17 18 19 20 Time (min) 21 22 23 24 RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.40 AA: 18464426 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 16.82 AA: 757 15 16 17 RT: 23.88 RT: 24 AA: 643 AA: 403 RT: 20.43 AA: 1802 18 19 20 Time (min) 21 22 23 24 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 2-Naphthyamin Y = -202944+1.15958e+006*X R^2 = 0.9940 W: 1/X 12000000 11000000 10000000 9000000 NTA 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 mg/kg RT: 15.00 - 25.00 SM: 5G 10 RT: 22.17 AA: 1084562 100 80 60 mg/kg 40 RT: 24.07 AA: 2584 20 15 16 17 18 19 20 21 Time (min) 22 23 24 RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.20 AA: 2273343 100 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 12 20 10 RT: 23.75 AA: 2597 RT: 24 AA: 86 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Time (min) RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.18 AA: 6775916 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 24 AA: 224 15 16 17 18 19 20 Time (min) 21 22 23 24 RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.20 AA: 10203976 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 RT: 23.71 10 AA: 5419 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Time (min) RT: 15.00 - 25.00 SM: 15G RT: 22.21 AA: 11729068 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 15 16 17 18 19 20 Time (min) 21 22 23 24 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 4-clo-2-toluidine Y = 9699.54+126367*X R^2 = 0.9977 W: 1/X 1200000 COT 1000000 800000 600000 400000 200000 0 RT: 20.00 - 30.00 SM: 5G mg/kg 10 RT: 23.57 AA: 136058 100 80 60 mg/kg 40 RT: 25.16 AA: 2620 RT: 21.98 AA: 1472 20 RT: 27.02 AA: 2905 RT: 29.47 AA: 1391 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 23.56 AA: 322670 10 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 13 RT: 20.14 10 RT: 27.68 AA: 4861 AA: 1629 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 23.58 AA: 823132 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 22.10 AA: 1147 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 28 29 RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 23.60 AA: 1199215 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 RT: 25.35 AA: 6019 10 RT: 26.82 AA: 2598 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 RT: 28.46 AA: 2560 RT: 29 AA: 55 28 29 28 29 RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 23.61 AA: 1225320 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 RT: 25.40 10 RT: 26.76 AA: 2200 AA: 5159 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 2,4,5-trimetylaniline Y = 25560.8+361502*X R^2 = 0.9962 W: 1/X 4000000 3500000 3000000 TMA 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 mg/kg RT: 20.00 - 30.00 SM: 5G 10 RT: 25.82 AA: 396011 100 80 60 mg/kg 40 20 RT: 21.32 RT: 23.50 RT: 24.62 RT: 27.30 RT: 28.77 AA: 10448 AA: 2073 AA: 8744 AA: 14768 AA: 25485 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 28 29 RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 25.81 AA: 893016 100 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 14 RT: 20.22 10 RT: 23.52 RT: 22.43 AA: 7415 RT: 24.76 AA: 24479 AA: 16741 AA: 8526 RT: 28.42 RT: 28.88 AA: 4226 AA: 7294 RT: 29.7 AA: 1586 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 25.83 AA: 1946367 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 RT: 21.13 10 RT: 22.53 AA: 9015 RT: 28.86 RT: 23.66 AA: 10083 AA: 9623 AA: 13641 RT: 29.32 AA: 21176 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 28 29 RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 25.86 AA: 3042386 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 20.65 RT: 21.39 AA: 6321 AA: 12560 RT: 27.80 RT: 22.90 RT: 29.4 AA: 306 AA: 13186 AA: 9821 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 25.83 AA: 3400802 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 20.94 AA: 10842 RT: 27.69 AA: 13960 RT: 23.58 AA: 26929 RT: 22.22 AA: 6595 RT: 29.24 AA: 9003 20 21 22 23 24 25 Time (min) 26 27 28 29 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 3,3-dimetyl-4,4-diaminodiphenylmetal Y = -2.09639e+006+8.57414e+006*X R^2 = 0.9939 W: 1/X 90000000 80000000 70000000 DPM 60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 RT: 20.00 - 30.00 SM: mg/kg 5G 10 RT: 27.92 AA: 7071547 100 80 60 mg/kg 40 20 RT: 20.36 AA: 1939 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 27.95 AA: 16314338 10 90 80 70 15 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 20.26 AA: 9915 20 RT: 26.28 AA: 4729 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 27.93 AA: 47291546 10 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 20.36 AA: 10293 20 RT: 25.75 AA: 2730 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 27.99 AA: 71892791 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 20 RT: 20.22 AA: 13985 RT: 22.24 AA: 5992 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Time (min) RT: 20.00 - 30.00 SM: 15G RT: 27.96 AA: 80789589 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 20 RT: 21.33 AA: 2721 21 RT: 22.22 AA: 3302 22 RT: 23.97 AA: 3739 23 24 RT: 26.72 AA: 2085 25 Time (min) 26 27 28 29 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 4-aminobiphenyl Y = -108836+3.54265e+006*X R^2 = 0.9933 W: 1/X 35000000 30000000 ABP 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 RT: 25.00 - 35.00 SM: 5G mg/kg 10 RT: 29.78 AA: 3639462 100 80 60 mg/kg 40 20 RT: 25.25 RT: 27.18 AA: 6682 AA: 1255 25 26 RT: 32.42 AA: 5013 27 28 29 30 31 32 RT: 34.05 A A: 7802 33 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 29.78 AA: 7321541 100 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 16 10 RT: 26.87 RT: 27.41 AA: 3950 AA: 3821 25 26 27 RT: 31.18 AA: 2510 RT: 28.34 AA: 5170 28 29 30 31 RT: 32.92 RT: 33.31 AA: 4298 AA: 2025 32 33 RT: 34.24 AA: 5329 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 29.79 AA: 20189699 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 26.65 AA: 5277 25 26 RT: 27.31 AA: 13079 27 RT: 32.66 AA: 6511 28 29 30 31 32 RT: 33.13 AA: 6153 RT: 34.14 AA: 11455 33 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 29.82 AA: 31090301 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 25 RT: 26.32 AA: 2407 26 RT: 31.84 RT: 32.38 AA: 3583 AA: 3878 RT: 27.18 AA: 4285 27 28 29 30 Time (min) 31 32 31 32 RT: 33.16 AA: 4604 33 34 RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 29.79 AA: 33887383 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 34 AA: 127 25 26 27 28 29 30 Time (min) 33 34 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 3,3-diclobenzidine Y = -252827+283925*X R^2 = 0.9909 W: 1/X 2500000 DBZ 2000000 1500000 1000000 500000 0 mg/kg RT: 25.00 - 35.00 SM: 5G 10 RT: 32.34 AA: 117894 100 80 60 mg/kg 40 RT: 26.88 AA: 3958 20 RT: 29.12 RT: 30.64 AA: 8047 AA: 7812 RT: 34.44 AA: 31438 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 32.34 AA: 324583 100 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 17 RT: 31.37 20 RT: 26.48 AA: 16468 RT: 25.24 AA: 10356 10 RT: 27.18 RT: 28.69 AA: 1264 RT: 30.87 AA: 8654 AA: 6090 RT: 29.70 RT: 34.4 AA: 6426 AA: 3147 AA: 1216 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 32.36 AA: 1119098 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 25.64 AA: 8178 25 26 RT: 27.23 AA: 4952 RT: 27.86 AA: 5271 27 RT: 28.94 AA: 2783 28 29 RT: 31.00 AA: 8565 RT: 29.52 AA: 6341 30 Time (min) 31 RT: 34.37 AA: 2530 32 33 34 RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 32.39 AA: 2141282 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 25.28 AA: 14762 RT: 27.03 RT: 27.45 AA: 2248 AA: 4254 RT: 29.40 RT: 29.86 AA: 1656 AA: 3245 25 26 27 28 29 30 RT: 34.17 AA: 5001 RT: 31.26 AA: 2304 31 32 33 34 Time (min) RT: 25.00 - 35.00 SM: 15G RT: 32.35 AA: 3017015 100 90 80 70 10 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 25.17 AA: 11563 25 26 27 28 RT: 34.02 RT: AA: 5981 AA: RT: 29.60 RT: 30.41 AA: 4617 AA: 3964 RT: 28.32 AA: 7882 29 30 Time (min) 31 32 33 34 STT Amin thơm Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 4,4-metylen-bis-(2-cloaniline) Y = 262165+1.1597e+006*X R^2 = 0.9947 W: 1/X 12000000 10000000 MTB 8000000 6000000 4000000 2000000 0 RT: 30.00 - 40.00 SM: 5G mg/kg 10 RT: 34.36 AA: 1407693 100 80 60 mg/kg 40 20 RT: 36.46 RT: 37.19 AA: 4192 AA: 2002 RT: 30.48 AA: 47 91 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Time (min) RT: 30.00 - 40.00 SM: 15G RT: 34.40 AA: 2951984 00 90 80 70 2,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 30 RT: 35.84 AA: 2279 RT: 32.19 AA: 2189 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Time (min) 18 RT: 30.00 - 40.00 SM: 15G RT: 34.37 AA: 7282854 100 90 80 70 mg/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 33.09 AA: 6346 30 31 32 33 RT: 36.66 RT: 37.44 AA: 1821 AA: 2019 34 35 Time (min) 36 37 38 39 RT: 30.00 - 40.00 SM: 15G RT: 34.41 AA: 9321921 100 90 80 70 7,5 mg/kg 60 50 40 30 20 10 30 RT: 35.81 AA: 2870 RT: 30.68 AA: 2846 31 32 33 34 35 Time (min) 36 RT: 38.64 AA: 8119 37 38 39 RT: 30.00 - 40.00 SM: 15G RT: 34.41 AA: 11051805 100 90 80 70 10 g/kg 60 50 40 30 20 10 RT: 32.51 AA: 4778 30 31 32 RT: 39.46 AA: 6137 33 34 35 Time (min) 36 37 38 39 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 18 AMIN THƠM BẰNG HỆ THỐNG HPLC – MS/MS  Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Hóa học PHẠM VI ỨNG DỤNG Hƣớng dẫn quy định phƣơng pháp xác định amin thơm biết giải phóng từ thuốc nhuộm azo mẫu da Giới hạn phát phƣơng pháp 0,5 mg/Kg mẫu da NGUYÊN TẮC PHƢƠNG PHÁP Sau loại dầu, mỡ chất chống thấm n-hexan, thuốc nhuộm azo mẫu da đƣợc chiết dung dịch đệm citrat (pH=6,0) 70 oC bình kín Các chất amin thơm (Bảng 1) đƣợc giải phóng từ thuốc nhuộm azo phản ứng khử với natri đithionit Các chất amin thơm sau đƣợc tách khỏi dung dịch chiết phƣơng pháp chiết lỏng lỏng sử dụng methyl-t-butyl ether (MTBE) Tiến hành phân tích xác định amin thiết bị sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép HPLC-MS/MS Bảng Danh sách chất chuẩn amin thơm STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Tên amin 4-Aminobiphenyl Benzidine 4-Chloro-o-toluidine 2-Naphthylamine 4-Chloroaniline 2,4-Diaminoanisol 4,4‟-Diaminodiphenylmetan 3,3‟-Dichlorobenzidine 3,3‟-Dimetoxybenzidine 3,3‟-Dimethylbezidine 3,3‟-Dimethyl-4,4‟-diaminodiphenylmetan 4-Cresidine 4,4‟-Methyl-bis-(2-chloroaniline) 4,4‟-Oxydianiline 4,4‟-Thiodianiline 2-Toluidine 2,4-Diamonitoluene 2,4,5-Trimethyl anilin Số CAS 92-67-1 92-87-5 95-69-2 91-59-8 106-47-8 615-05-4 101-77-9 91-94-1 119-90-4 119-93-7 838-88-0 120-71-8 101-14-4 101-80-4 139-65-1 95-53-4 95-80-7 137-17-7 THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT 3.1 Thiết bị - Sắc ký lỏng hiệu cao: HPLC/DAD Dionex Ultimate 3000 ghép nối đầu dò khổi phổ kép Thermo TSQ Quantum Access Max - Thiết bị lắc có ổn định nhiệt: GynomaxTM 929 – Amerex Instrument, Inc 103 Luận văn Thạc sỹ Tạ Thị Ngọc Ánh  Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Bể siêu âm có điều chỉnh nhiệt: Elmasonic S300H - Cột chiết lỏng lỏng: Chromabond XTR (70 mL, 14,5 g Kieselgur) - Hệ thổi khí nitơ: độ tinh khiết 99,99% - Màng lọc mẫu: màng nylon 0,45µm - Micropipet 20 – 200 µL 100 – 1000 µL - Pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25mL - Bình định mức với thể tích khác - Bình phản ứng thủy tinh chịu nhiệt, kín khí Khoa Hóa học 3.2 Hố chất - Dung dịch chuẩn 18 amin thơm (Bảng 1) - Metanol (MeOH) – HPLC grade - n-hexan – HPLC grade - Acetonitrile (ACN) – HPLC grade - Methyl-t-butyl ether (MTBE) – Analytical grade - Amoni đihiđrophotphat (NaH2PO4) (độ tinh khiết >99,0%) - Natri hiđrophotphat (Na2HPO4) (độ tinh khiết >99,0%) - Natri hiđroxit (NaOH) (độ tinh khiết >96%) - Axit citric (độ tinh khiết >99,5%) - Axit formic (FA) (độ tinh khiết 98%) - Dung dịch natri đithionit 200 mg/mL, chuẩn bị ngày (hoá chất kỹ thuật-Labosi) - Dung dịch đệm citrat (pH=6): 12,526 g axit citric 6,32 g natri hiđroxit, định mức đến 1000 mL nƣớc cất - Chlorobenzene (độ tinh khiết >99,0%) - Nƣớc cất deion LẤY MẪU VÀ CHUẨN BỊ MẪU Nếu lấy mẫu thử phù hợp với TCVN 7117 nghiền da theo TCVN 7126: 2002 Nếu khơng lấy mẫu theo TCVN 7117 (ví dụ nhƣ da lấy từ sản phẩm hoàn thiện nhƣ giầy ủng, quần áo) chi tiết trình lấy mẫu phải đƣợc ghi báo cáo thử nghiệm Đối với q trình phân tích, mẫu đại diện gồm 1,0 g (± 0,10 g) da nghiền (kích thƣớc mm ± 0,5 mm) đƣợc cân xác cho vào bình phản ứng CÁCH TIẾN HÀNH 6.1 Xử lý mẫu Bước 1: Loại chất béo 115 Luận văn Thạc sỹ Tạ Thị Ngọc Ánh Cân 1,0 g mẫu da (chính xác đến ± 0,10 g) nghiền vào bình kín 50 ml, thêm 20 ml n-hexan siêu âm 40 oC 20 phút Lớp n-hexan sau đƣợc gạn khỏi mẫu da Mẫu da đƣợc xử lý nhƣ với hai lần 20 ml n-hexan Sau gạn bỏ dung môi n- hexan, mẫu da đƣợc loại bỏ hoàn toàn n-hexan cách để bay tự nhiên qua đêm bình để mở Bước 2: Tách, khử Cho 17 mL dung dịch đệm citrat đƣợc đun nóng trƣớc đến 70oC vào mẫu thử Bình phản ứng đƣợc đậy kín lắc bể điều nhiệt 25 phút 70oC Sau thêm ml natri đithionit 200 mg/mL giữ bình phản ứng 20 phút 70oC để khử thuốc nhuộm azo sinh amin thơm Sau trình khử, mẫu đƣợc làm nguội đến nhiệt độ phòng bể nƣớc nguội Bước 3: Chiết lỏng - lỏng Dung dịch mẫu sau tách khử đƣợc gạn vào ống ly tâm 50mL cho thêm 1mL NaOH 1M g NaCl để dung dịch có mơi trƣờng kiềm Cho thêm 10 ml MTBE lắc mạnh để hai pha trộn lẫn vào Sau đó, mẫu đƣợc ly tâm 10 phút 4500 vòng/phút để phân lớp Hút lớp MTBE vào ống định mức thuỷ tinh Cô cạn dung mơi MTBE đến hồn tồn dịng khí nitơ Thêm vào 500 µL methanol 500 µL H2O để hòa tan cặn Lọc dung dịch mẫu cuối qua màng lọc 0,45 µm bơm µL vào hệ thống HPLC-MS/MS để xác định hàm lƣợng amin thơm 6.2 Kiểm tra hệ thống phân tích Để kiểm tra độ thu hồi q trình phân tích, cho 1,0 ml dung dịch chuẩn nồng độ 30 mg/L vào bình phản ứng có chứa 17 ml dung dịch đệm citrate (đã đun nóng đến 70 0C) 1,0 g (± 0,10 g) mẫu da trắng Tiến hành xác định hàm lƣợng amin thơm nhƣ quy trình (5.1) Tỷ lệ thu hồi đạt đƣợc phải 20% 2,4Diaminoanisol, 50% 2-Toluidine 2,4-Diaminotoluene, amin lại tỉ lệ thu hồi đạt 70% 6.3 Hiệu chuẩn Nồng độ chất amin mẫu thử nghiệm đƣợc xác định phƣơng pháp đƣờng chuẩn (xem 6.4) 6.4 Xây dựng đƣờng chuẩn Đƣờng chuẩn mẫu da trắng đƣợc dựng khoảng nồng độ 1,0 – 10,0 mg/Kg chạy HPLC-MS/MS Cân 05 mẫu da trắng với khối lƣợng 1,0 g (± 0,10 g) vào 05 bình tam giác 50 mL Tiến hành loại mỡ theo bƣớc (5.1) Thêm 17 mL đệm citrate đƣợc đun nóng đến 70 0C vào bình thuỷ tinh Thêm vào dung dịch chuẩn hỗn hợp amin thơm (xem 3.2) với lƣợng nhƣ Bảng (phân tích HPLC-DAD) Bảng (phân tích HPLCMS/MS) Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa tƣơng quan diện tích pic hàm lƣợng amin thơm Bảng Xây dựng đƣờng chuẩn mẫu da trắng HPLC-MS/MS Điểm chuẩn Dung dịch chuẩn hỗn hợp 50 mg/L 50 mg/L 50 mg/L 50 mg/L 50 mg/L Lƣợng thêm chuẩn 200 µL 150 µL 100 µL 50 µL 25 µL Lƣợng cân mẫu da 1,0 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g Nồng độ amin thơm mẫu da blank 10 mg/Kg 30 mg/Kg mg/Kg 2,5 mg/Kg mg/Kg 6.5 Phân tích định tính sắc ký lỏng hai lần khối phổ HPLC/MS-MS Dung dịch mẫu cuối đƣợc pha loãng với tỉ lệ 1:10 metanol bơm 5µL vào hệ thống HPLC-MS/MS để xác định amin thơm có mặt mẫu Các thông số chạy thiết bị HPLC-MS/MS đƣợc thiết lập nhƣ Bảng 5: Bảng 5: Thông số thiết lập cho HPLC-MS/MS Dung môi rửa giải 1: Dung môi rửa giải 2: Cột sắc ký: Nhiệt độ lò cột : Tốc độ dòng: Gradient: MeOH H2 O Hypersil Gold C18 150mm x 2,1mm, 3µm 40 oC 0,25 ml/phút Bắt đầu 10% dung dịch rửa giải 1, tăng đến 80% dung dịch rửa giải 45 phút Thể tích bơm mẫu: µl Nguồn ion hố: Spray voltage = 4500V Sheath gas = 45 psi Thiết lập thông số cho detector Auxiliary gas = psi hai lần khối phổ MS/MS: Capillary temp = 2700C Vaporized temp = 2500C Skimmer offset = -12 V Tube lens offset = 90 V Ion mẹ Ion Năng TT Amin thơm (m/z) (m/z) lƣợng (V) 2,4-Diaminoanisol 173,3 141 10 10 11 12 13 14 15 16 17 18 2,4-Diaminotoluene o-Toluidine Benzidin 4,4'-Oxydianiline 4-Chloroaniline 4-Cresidine 4.4-Diaminodiphenylmetan 3,3'-Dimethoxybenzidine 3,3-Dimetylbenzidine 4,4'-Thiodianiline 2-Naphtyamine 4-Chloro-2-toluidine 2,4,5-Trimetylaniline 3,3-Dimetyl-4,4'-diaminodiphenylmetan 4-Aminobiphenyl 3,3'-Dichlorobenzidine 4,4'-methylene-bis-(2-chloroaniline) 123,1 108,1 185,4 201,1 128,1 138,1 199,1 245,0 213,1 217 144,1 142,1 136,2 227,1 170,0 253,0 267,0 108 91 168 108 93 123 106 230 196 124 127 107 121 120 152 217 231 18 17 17 19 17 14 23 18 18 19 22 16 14 26 29 19 20 Tính tốn kết Hàm lƣợng amin thơm mẫu da đƣợc xác định phƣơng pháp đƣờng chuẩn Nồng độ amin thơm có mẫu da đƣợc xác định theo công thức sau: Trong đó: Cmẫu : Hàm lƣợng amin mẫu da (mg/Kg) Cđo : Hàm lƣợng amin thơm đo đƣợc mẫu (mg/Kg) Cblank : Hàm lƣợng amin thơm đo đƣợc mẫu blank (mg/Kg) N : Hệ số pha loãng (nếu có) 7.1 Đảm bảo kết thử nghiệm Hệ số hồi qui tuyến tính xây dựng đƣờng hiệu chuẩn R2 ≥ 0,99 Tất lần đo phải kiểm tra mẫu trắng 7.2 Báo cáo kết thử nghiệm Báo cáo kết cần có thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 7536:2005/ISO 17234:2003 b) Loại, nguồn gốc mô tả mẫu phân tích phần mẫu c) Bất kỳ sai lệch so với quy trình phân tích, bƣớc tiến hành đặc biệt thêm vào d) Kết phân tích tính theo mg/Kg chất amin thơm đƣợc liệt kê riêng biệt báo cáo dựa vào giá trị ngƣỡng sau: • Trong trường hợp giá trị amin < 30 mg/Kg: Theo phân tích tiến hành, thuốc nhuộm azo giải phóng amin thơm liệt kê khơng phát đƣợc • Trong trường hợp giá trị amin > 30 mg/Kg: kết phân tích cho thấy mẫu da đƣa để xem xét đƣợc sản xuất xử lý có sử dụng thuốc nhuộm azo có giải phóng nhiều loại amin liệt kê Trong trường hợp mức 4-aminodiphenyl và/hoặc 2-napthylamine > 30 mg/Kg: sử dụng phƣơng pháp phát 4-aminođipheny và/hoặc 2-napthyamin Theo hiểu biết khẳng định chắn sử dụng thuốc nhuộm azo có giải phóng amin liệt kê khơng có thêm thơng tin ...TẠ THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ AMIN THƠM TRONG CÁC SẢN PHẨM DA BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC/ MS/ MS CHUN NGÀNH: HĨA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn... mẫu phân tích amin thơm da thiết bị HPLC -MS/ MS, nghiên cứu dựa phƣơng pháp phân tích tiêu chuẩn (CEN ISO/TS 17234, DIN 53316) nghiên cứu đƣợc giới công nhận Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp. .. 14: Ảnh hƣởng số lần chiết đến độ thu hồi 48 Hình 16: Quy trình xử lý mẫu da phân tích amin thơm HPLC -MS/ MS 49 Hình 15: : Quy trình xử lý mẫu da phân tích amin thơm HPLC -MS/ MS