(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực (salvia miltiorrhiza bunge, lamiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ : 62720405 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đào Thị Vui PGS.TS Nguyễn Thành Hải HÀ NỘI, NĂM 2021 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer dạng phổ biến hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp người cao tuổi Số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng tuổi thọ trung bình ngày cao [20], [182] Theo số liệu thống kê năm 2019 World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ tồn giới, 60-80% trường hợp bệnh Alzheimer [16], [20] Tỷ lệ mắc tăng 5-7 triệu người năm, ước tính khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050 [182] Bệnh Alzheimer xác định nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu Hoa Kỳ, với chi phí điều trị lớn trở thành gánh nặng xã hội [20], [21] Cho đến nay, có bốn thuốc chấp thuận điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức bệnh Alzheimer [51], [60], [138] Trong đó, ba thuốc có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase donepezil, galantamin rivastigmin liên quan đến giả thuyết cholinergic chế bệnh sinh bệnh Alzheimer Một thuốc cịn lại có tác dụng ức chế thụ thể NMDA memantin liên quan đến giả thuyết glutamat [51] Tuy nhiên, đích tác dụng không hướng tới giả thuyết cholinergic hay giả thuyết glutamat đơn lẻ mà hướng đến giả thuyết khác giả thuyết β-amyloid, giả thuyết protein tau hay giả thuyết stress oxy hóa [18], [42] Do đó, nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer nhà nghiên cứu giới quan tâm Trong trình nghiên cứu phát triển thuốc, hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu giữ vai trò quan trọng điều trị bệnh Alzheimer Điều minh chứng thơng qua nửa số thuốc cấp phép điều trị bệnh Alzheimer có nguồn gốc từ dược liệu [157] Ưu điểm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tác dụng phụ đem lại lợi ích kinh tế bệnh mạn tính Alzheimer [163] Vì vậy, nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu điều trị bệnh Alzheimer hướng phù hợp nước mạnh nguồn thực vật Việt Nam Đan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae), sử dụng 1000 năm qua nhiều nước giới, đặc biệt khu vực châu Á để điều trị bệnh thần kinh; bệnh tim mạch; ung thư; tiểu đường, suy thận số bệnh khác [163], [196] Một số nghiên cứu giới bắt đầu ghi nhận hoạt chất phân lập từ rễ Đan sâm có nhiều tiềm điều trị bệnh Alzheimer [95], [178], [239] Các hoạt chất thể tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ in vivo test hành vi thông qua khả ức chế enzym acetylcholinesterase, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính β-amyloid hay chống stress oxy hóa [137], [163] Tại Việt Nam, Đan Sâm di thực từ Trung Quốc trồng số tỉnh phía bắc Lào Cai, Sơn La cho kết phát triển tốt [10] Tuy nhiên, nghiên cứu nước ghi nhận cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase chống oxy hóa in vitro [8] Hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ tác dụng dược lý Đan sâm di thực theo hướng điều trị bệnh Alzheimer Câu hỏi đặt là: Liệu Đan sâm di thực có tác dụng điều trị bệnh Alzheimer hay khơng tác dụng đích nào? Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer thực nghiệm Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)” với mục tiêu cụ thể sau: Nghiên cứu tác dụng cao rễ Đan sâm mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thơng qua số test hành vi Đánh giá tác dụng cao rễ Đan sâm số đích liên quan đến chế bệnh sinh bệnh Alzheimer Kết đề tài góp phần định hướng cho thử nghiệm lâm sàng để phát triển dược liệu Đan sâm di thực thành sản phẩm dùng rộng rãi cộng đồng để điều trị bệnh Alzheimer Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.1 Khái niệm Bệnh Alzheimer mô tả lần vào năm 1906 bác sỹ người Đức Alois Alzheimer Tuy nhiên phải đến năm 1984, khái niệm tương đối hoàn chỉnh bệnh Alzheimer đưa đồng thuận Viện quốc gia đột quỵ rối loạn thần kinh, giao tiếp Hiệp hội bệnh Alzheimer rối loạn liên quan Trong đó, Alzheimer bệnh rối loạn não đặc trưng trạng thái trí nhớ tiến triển xảy giai đoạn cuối đời Các đặc điểm bệnh bao gồm thối hóa số tế bào thần kinh, xuất mảng βamyloid ngoại bào đám rối nội thần kinh; rối loạn chế truyền tin hệ cholinergic não trước, ảnh hưởng đến hệ noradrenegic somatostatinergic [144] 1.1.2 Dịch tễ Bệnh Alzheimer dạng phổ biến hội chứng sa sút trí tuệ số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng tuổi thọ trung bình ngày cao, ước tính tăng gấp ba lần vào năm 2050 [15] Số lượng người mắc bệnh Alzheimer chiếm 60-80% 50 triệu ca mắc sa sút trí tuệ tồn giới [16], [20] Bệnh gặp chủ yếu người cao tuổi Tỷ lệ mắc bệnh chiếm khoảng 4% dân số 60 tuổi 20-40% dân số 85 tuổi [83], [89] Tỷ lệ mắc tăng 5-7 triệu người năm [182] Tỷ lệ mắc bệnh nữ nhiều nam [16] Thời gian sống trung bình sau khởi phát sa sút trí tuệ dao động từ 3,3 đến 11,7 năm [79] Ở Mỹ, số người 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer 5,8 triệu, chiếm 10% dân số 65 tuổi Ước tính đến năm 2050 số lượng bệnh nhân tăng lên 13,8 triệu Đây nguyên nhân tử vong hàng đầu Mỹ với 122.000 người chết vào năm 2018 [20], [21], [51] Ở Châu Âu, tỷ lệ mắc Alzheimer chiếm 5,1% dân số [243] Ở Châu Phi, tỷ lệ mắc 57,1% dân số 50 tuổi Với khu vực Châu Á, tỷ lệ mắc Hàn Quốc 4,8% dân số 65 tuổi; Trung Quốc 1,9% dân số 60 tuổi Đáng ý tỷ lệ mắc bệnh nước phát triển cao nước phát triển [181] Tại Việt Nam, chưa có báo cáo mang tính đại diện cho thực trạng bệnh Alzheimer nước Tuy nhiên, số nghiên cứu dịch tễ tiến hành đánh giá tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ số tỉnh ghi nhận Ba Vì, thành phố Hà Nội, tỷ lệ người 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm 4,5% dân số vào năm 2010 [7]; Đống Đa Sóc Sơn, thành phố Hà Nội chiếm 4,2% dân số vào năm 2014 [9] 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng 1.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng bệnh Alzheimer biểu qua rối loạn liên quan đến nhận thức không liên quan đến nhận thức Một số triệu chứng liên quan đến nhận thức suy giảm trí nhớ, suy giảm sử dụng động tác, suy giảm thị giác không gian, suy giảm ngôn ngữ suy giảm chức điều hành Trong số đó, suy giảm trí nhớ dấu hiệu lâm sàng điển hình nhất, thường xuất sớm mức độ tăng dần theo thời gian Alzheimer bệnh thối hóa thần kinh tiến triển trải qua ba giai đoạn gồm tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ sa sút trí tuệ [42], [195] Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh xuất số biểu rối loạn nhận thức giảm trí nhớ ngắn hạn ngơn ngữ Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ, người bệnh thường có biểu giảm trí nhớ ngắn hạn dài hạn kèm theo giảm chức điều hành, ngôn ngữ thị giác khơng gian Giai đoạn sa sút trí tuệ tiến triển theo ba mức độ: nhẹ, trung bình nặng Trong giai đoạn sa sút trí tuệ mức độ nặng, người bệnh có biểu trí nhớ kèm theo suy giảm nặng nề chức điều hành, sử dụng động tác, ngôn ngữ thị giác khơng gian nên phải phụ thuộc hồn tồn vào người chăm sóc [14], [145], [195] Ngồi ra, bệnh Alzheimer biểu qua triệu chứng không liên quan đến nhận thức bao gồm rối loạn hành vi, tâm thần cảm xúc thờ ơ, kích động, gây hấn, không hợp tác, lang thang; hoang tưởng, ảo giác, co giật, động kinh; thay đổi tính khí, lo âu, rối loạn giấc ngủ trầm cảm [42], [195] Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh chưa có biểu rối loạn hành vi, tâm thần hay cảm xúc Những rối loạn bắt đầu xuất giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ trở nên trầm trọng giai đoạn sút trí tuệ mức độ nặng [14], [15], [51], [80], [145], [195] 1.1.3.2 Đặc điểm cận lâm sàng Đặc điểm cận lâm sàng bệnh Alzheimer xác định thông qua xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh, xét nghiệm dịch não tủy hay sinh hóa Trong giai đoạn tiền lâm sàng ghi nhận số thay đổi xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh dịch não tủy không ghi nhận thay đổi xét nghiệm sinh hóa Trong giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ giai đoạn sa sút trí tuệ ghi nhận thay đổi xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh, dịch não tủy sinh hóa, mức độ khác [14], [80], [195] Chi tiết trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh Alzheimer [14], [80], [195] Đặc điểm cận lâm sàng Giai đoạn tiền lâm sàng Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ sa sút trí tuệ Xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh - Có khơng có tích lũy mảng amyloid - Có tượng chất xám, phần vỏ não teo vùng hải mã Xét nghiệm dịch não tủy - Nồng độ protein tau tau - Nồng độ protein tau tau phosphoryl hóa tăng cao phosphoryl hóa tăng cao - Nồng độ β-amyloid1-42 thấp - Nồng độ β-amyloid1-42 tăng cao Xét nghiệm sinh hóa - Nồng độ chất đánh dấu sinh học liên quan đến phản ứng viêm, stress oxy hóa chất đánh dấu liên quan đến thối hóa tế bào thần kinh chết tế bào tăng cao - Có tích lũy mảng amyloid - Có tượng teo vùng thái dương trung gian, giảm thể tích vùng hải mã, giảm tưới máu vỏ não 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh đích liên quan đến chế bệnh sinh Alzheimer bệnh thối hóa thần kinh phức tạp Cơ chế bệnh sinh bệnh mô tả dựa nhiều giả thuyết khác Một số giả thuyết đề cập đến bao gồm giả thuyết cholinergic, giả thuyết glutamat, giả thuyết βamyloid, giả thuyết tau giả thuyết stress oxy hóa [106], [184] 1.1.4.1 Giả thuyết cholinergic đích liên quan Giả thuyết cholinergic đề xuất vào năm 1976 Davies P Maloney A J [44] Hệ cholinergic biết đến hệ thống dẫn truyền thần kinh quan trọng não có vai trị điều hịa hoạt động trí nhớ [41] Dẫn truyền tín hiệu cholinergic diễn theo hai đường Con đường thứ từ nhân Meynert đến khu vực não trước bao gồm vỏ não liên quan đến học nhớ vận động Con đường thứ hai từ nhân vách ngăn hải mã tới khu vực hải mã liên quan đến học nhớ ngắn hạn [169], [175], [204] Trong đường truyền tin hệ cholinergic, acetylcholin chất dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất, tổng hợp xúc tác enzym cholin acetyltransferase (ChAT) phân bố nhiều khu vực não trước, não giữa, hồi hải mã thân não Sau gắn hoạt hóa receptor muscarinic hay nicotinic, acetylcholin bị thủy phân tác dụng enzym cholinesterase tạo thành cholin acetat khơng có tác dụng dẫn truyền [85], [123] Trong thể, có hai dạng enzym cholinesterase acetylcholinesterase (AChE) butyrylcholinesterase (BuChE) Trong đó, enzym AChE chịu trách nhiệm thủy phân acetylcholin thần kinh trung ương, enzym BuChE chiếm ưu khu vực ngoại vi [91], [110] Quá trình tổng hợp thủy phân acetylcholin trình bày hình 1.1 Hình 1.1 Quá trình tổng hợp thủy phân acetylcholin [123] Trong trường hợp giảm tổng hợp acetylcholin giảm biểu receptor dẫn đến giảm nồng độ acetylcholin khu vực vỏ não hải mã Từ làm rối loạn q trình truyền tin hệ cholinergic dẫn đến thối hóa, teo chết tế bào thần kinh, đặc trưng bệnh Alzheimer [24], [37], [71], [106], [204] Trên sở giả thuyết cholinergic số đích tác dụng điều trị bệnh Alzheimer nghiên cứu, bao gồm: - Ức chế enzym cholinesterase: Đặc biệt ức chế enzym AChE làm bền vững tăng nồng độ acetylcholin thần kinh trung ương nên có khả cải thiện trí nhớ Đây đích tác dụng quan trọng thuốc điều trị bệnh Alzheimer [85] - Chủ vận receptor acetylcholin: Bao gồm chủ vận receptor muscarinic nicotinic làm kích thích thần kinh trung ương, giúp tăng cường tín hiệu acetylcholin nên có khả cải thiện trí nhớ [79], [91], [175] 1.1.4.2 Giả thuyết glutamat đích liên quan Giả thuyết glutamat hình thành vào năm 1988 Simpson M.D.C [192] Glutamat biết đến chất dẫn truyền thần kinh kích thích hệ thần kinh trung ương, có vai trị học tập trí nhớ [106] Trong trình truyền tin, glutamat gắn hoạt hóa receptor hệ thần kinh trung ương mà phần lớn thông qua receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA) Khi trình khử cực diễn ra, receptor NMDA hoạt hóa, dịng Ca2+ vào màng sau synap, glutamat chuyển thành glutamin dự trữ cúc tận màng trước synap [106], [215] Thông thường, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) có vai trị điều hịa cường độ tín hiệu receptor NMDA thơng qua kiểm sốt dịng Ca2+ vào màng sau synap [112] Trong trường hợp thiếu hụt BDNF tích lũy glutamat ngoại bào làm kích thích mức receptor NMDA Khi dịng Ca2+ tràn vào tế bào chất làm rối loạn chức ty thể dẫn đến thối hóa, teo chết tế bào thần kinh, đặc trưng bệnh Alzheimer [85], [106], [112], [215] Chi tiết minh họa hình 1.2 Hình 1.2 Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết glutamat [112] Trên sở giả thuyết glutamat số đích tác dụng điều trị bệnh Alzheimer nghiên cứu, bao gồm: - Ức chế receptor NMDA: Receptor NMDA bị kích thích mức xuất tích lũy glutamat ngoại bào Từ gây rối loạn chức dẫn truyền làm thối hóa chết tế bào thần kinh Do đó, ức chế receptor NMDA ngăn cản rối loạn chức ty thể từ cải thiện chức tế bào [79], [85], [105], [236] - Ức chế giải phóng glutamat tăng cường trình tái hấp thu glutamat: Quá trình ức chế giải phóng màng trước synap tăng cường tái hấp thu glutamat làm giảm nồng độ glutamat ngoại bào, từ giảm kích thích receptor NMDA dẫn đến giảm rối loạn chức tế bào [43], [79], [105], [236] 1.1.4.3 Giả thuyết β-amyloid đích liên quan Peptid β-amyloid phân lập lần nhóm nghiên cứu Glenner G G vào năm 1984 [65] Nhưng phải đến năm 1991, giả thuyết β-amyloid đề xuất Hardy J Allsop D [56], [72] Trong đó, β-amyloid sản phẩm trình phân cắt protein tiền chất amyloid (APP) Trong đó, APP loại glycoprotein xuyên màng, liên quan đến q trình tăng trưởng, điều hịa sống tế bào thần kinh phân cắt theo hai đường [66], [158], [175], [240] Trong đường sinh lý, APP cắt α-secretase tạo APP (sAPPα) có tác dụng bảo vệ thần kinh Phần lại tiếp tục cắt γ-secretase tạo peptid P3 APP nội bào không gây độc thần kinh [24], [38], [47], [175] Trong đường bệnh lý, APP cắt β-secretase (BACE) tạo nên phân đoạn khác APP (sAPPβ) Phần lại tiếp tục cắt γ- secretase xúc tác presenilin giải phóng β-amyloid APP nội bào [175] Q trình tạo hai peptid β-amyloid β-amyloid1-40 (có 40 acid amin) βamyloid1-42 (có 42 acid amin) β-Amyloid1-40 dạng hịa tan, độc thần kinh; β-amyloid1-42 dạng khơng tan, có xu hướng ngưng tụ thành mảng βamyloid có độc tính thần kinh cao [106] Mảng β-amyloid sau tạo thành ngoại bào tương tác với tế bào thần kinh làm kích hoạt xung động viêm, stress oxy hóa, tổn thương ty thể làm rối loạn chức dẫn truyền dẫn đến thoái hóa, teo chết tế bào thần kinh, đặc trưng bệnh Alzheimer [24], [106], [184], [186] Chi tiết minh họa hình 1.3 Hình 1.3 Cơ chế bệnh sinh theo giả thuyết β-amyloid [175] Trên sở giả thuyết β-amyloid, nhiều đích tác dụng điều trị bệnh Alzheimer quan tâm nghiên cứu, bao gồm: - Các đích liên quan đến ức chế sản xuất β-amyloid: Các enzym secretase có vai trị xúc tác q trình phân cắt APP tạo β-amyloid có độc tính thần kinh Vì vậy, ức chế β-secretase, γ-secretase hoạt hóa α-secretase làm giảm sản xuất βamyloid theo đường bệnh lý [134], [138] - Các đích liên quan đến ức chế kết tập β-amyloid: Tăng cường liên kết chéo với sợi oligomer β-amyloid giúp ngăn chặn trình kết tập thành mảng β-amyloid từ làm giảm độc tính thần kinh [24], [105], [138] - Các đích liên quan đến tăng thải trừ β-amyloid: Thơng qua hoạt hóa protease giúp đẩy nhanh phân giải mảng β-amyloid, liên kết kháng thể, thực bào làm tăng thải trừ dẫn đến giảm độc tính β-amyloid gây [18], [24], [75] 8.4 Kết thử nghiệm xác định mức liều β-amyloid25-35 gây suy giảm trí nhớ - Ảnh hưởng mức liều β-amyloid25-35 test mê lộ chữ Y Trong test mê lộ chữ Y, ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đánh giá thông qua tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay Kết trình bày bảng 8.1 Bảng 8.1 Ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đến trí nhớ chuột test mê lộ chữ Y Lô Dung dịch tiêm vào não thất Tỷ lệ chuyển tiếp (%) Tổng số lần vào cánh tay Chứng sinh lý Nước cất 72,91 ± 9,03 47,0 ± 14,44 71,58 ± 4,64 38,44 ± 12,39 Chứng bệnh Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý β-amyloid25-35 nmol 1,82 58,76 ± 10,80## Chứng bệnh Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý ## β-amyloid25-35 nmol 49,33 ± 12,29 19,41 p0,05) - Ảnh hưởng mức liều β-amyloid25-35 test né tránh thụ động Trong test né tránh thụ động, ảnh hưởng tiêm não thất β-amyloid25-35 đánh giá thông qua thời gian tiềm tàng vào buồng tối pha luyện tập kiểm tra Kết trình bày bảng 8.2 xxviii Bảng 8.2 Ảnh hưởng β-amyloid25-35 tiêm vào não thất đến thời gian tiềm tàng vào buồng tối test né tránh thụ động Lô Dung dịch tiêm vào não thất Thời gian tiềm tàng vào buồng tối Pha luyện tập Pha kiểm tra Chứng sinh lý Nước cất 46,12 (35,05-57,05) 283,03 (146,14 - 300,0) Chứng bệnh β-amyloid25-35 nmol 63,0 (31,14-117,85) 300,0 (297,50 - 300,0) 19,59 (8,83-49,30) 42,84 (14,81-159,09)## Chứng bệnh β-amyloid25-35 nmol Tỷ lệ giảm so với chứng sinh lý ## 84,86 p0,05) Trong pha kiểm tra, lô chứng bệnh tiêm não thất β-amyloid25-35 liều nmol làm thời gian tiềm tàng vào buồng tối giảm 84,86% so với lô chứng sinh lý (p0,05) xxix PHỤ LỤC THẦM ĐỊNH MƠ HÌNH GÂY SUY GIẢM TRÍ NHỚ BẰNG TRIMETHYLTIN 9.1 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng, giống đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, – tuần tuổi, khối lượng ban đầu 20-25 g, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột ni điều kiện phịng thí nghiệm (nhiệt độ: 25 ± 2oC, độ ẩm: 60-70%), cho ăn thức ăn tiêu chuẩn uống nước tự điều kiện sáng tối đảo ngược (pha sáng: 19 - giờ; pha tối: - 19 giờ) 9.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 9.2.1 Hóa chất nghiên cứu Trimethyltin clorid 146498 Sigma Aldrich, Đức 9.2.2 Máy móc thiết bị nghiên cứu Bộ dụng cụ cho test mê lộ chữ Y, mê lộ nước Morris thiết kế theo hướng dẫn Panlab, Mỹ 9.3 Phương pháp nghiên cứu Trimethyltin hợp chất hữu thiếc có độc tính cao thần kinh trung ương Trong nghiên cứu thực nghiệm, trimethyltin tỷ lệ gây chết động vật tương đối cao Dựa nghiên cứu trước đây, mức liều trimethyltin tiêm phúc mạc hay dùng chuột nhắt gồm 2,3; 2,4; 2,5 mg/kg [39], [111], [118], [146], [166] Thời điểm đánh giá hành vi sau gây mô hình thường sau hay ngày [12], [99], [146] Do đó, đề tài tiến hành khảo sát: - Tỷ lệ động vật chết ba mức liều trimethyltin bao gồm: 2,3; 2,4; 2,5 mg/kg - Khả gây suy giảm trí nhớ test hành vi bắt đầu đánh giá sau ngày kể từ tiêm trimethyltin 9.3.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp trimethyltin chuột nhắt trắng - Thiết kế nghiên cứu Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô xxx Lô sinh lý: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô TMT1: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,3 mg/kg Lô TMT2: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,4 mg/kg Lô TMT3: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,5 mg/kg Sau thích nghi, chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với mức liều khác tương ứng với ba lô bệnh (riêng lô chứng sinh lý tiêm nước muối sinh lý) Theo dõi liên tục đầu đến 48 sau tiêm - Thông số đánh giá + Tình trạng chung chuột, hoạt động tự nhiên lại, leo trèo, tư thế, màu sắc mũi, tai, đuôi… dấu hiệu nhiễm độc nơn, co giật, kích động, tiết phân, nước tiểu… + Số lượng chuột chết vòng 48 sau tiêm 9.3.2 Phương pháp đánh khả gây suy giảm trí nhớ cuả trimethyltin test hành vi Dựa kết thử nghiệm đánh giá độc tính trimethyltin, lựa chọn mức liều có tỷ lệ gây chết động vật 48 thấp Trong thử nghiệm tiến hành đánh giá hành vi sau tiêm trimethyltin ngày - Thiết kế nghiên cứu Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô Lô sinh lý 2D: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô sinh lý 7D: Chuột tiêm phúc mạc nước muối sinh lý 0,2 ml/10 g cân nặng Lô TMT 2D: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với liều xác định từ TN1 Lô TMT 7D: Chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với liều xác định từ TN1 Sau thích nghi, chuột tiêm phúc mạc trimethyltin với mức liều xác định từ thử nghiệm với hai lô bệnh (riêng lô chứng sinh lý tiêm nước xxxi muối sinh lý) Ngày thứ 2, bắt đầu tiến hành test mê lộ chữ Y ngày thứ 5, bắt đầu tiến hành test mê lộ nước Morris lô sinh lý 2D lô TMT 2D Ngày thứ 7, bắt đầu tiến hành test mê lộ chữ Y ngày thứ 10, bắt đầu tiến hành mê lộ nước Morris lô sinh lý 7D lô TMT 7D Quy trình đánh giá trình bày hình - Thông số đánh giá Thông số đánh giá test hành vi (trình bày chi tiết mục 2.4.1.4), gồm có: + Trên test mê lộ chữ Y, thông số đánh giá gồm tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay + Trên test mê lộ nước Morris, thông số đánh giá gồm thời gian tiềm tàng để tìm thấy bến đỗ thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Hình 9.1 Quy trính đánh giá gây suy giảm trí nhớ trimethyltin test hành vi 9.4 Kết nghiên cứu 9.4.1 Kết đánh giá độc tính cấp trimethyltin Ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc đến số lượng chuột chết co giật trình bày bảng 9.1 xxxii Bảng 9.1 Ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc đến chuột nhắt trắng Liều Số lượng trimethyltin chuột co giật (mg/kg) (con) Lô (n=6) Chứng sinh lý Số lượng chuột chết (con) Tỷ lệ chuột chết co giật (%) 0 TMT1 2,3 16,7 TMT2 2,4 1 33,3 TMT3 2,5 50,0 Kết bảng 9.1 cho thấy lô bệnh TMT1 tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,3 mg/kg không gây chết chuột mà làm co giật 01 Trong hai lơ bệnh TMT2 TMT3 mức liều cao gây chết chuột Dựa vào kết trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg lựa chọn cho thử nghiệm đánh giả khả gây suy giảm trí nhớ 9.4.2 Kết khả gây suy giảm trí nhớ trimethyltin chuột nhắt 9.4.2.1 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ chữ Y Trong test mê lộ chữ Y, ảnh hưởng trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg đánh giá thông qua tỷ lệ chuyển tiếp tổng số lần vào cánh tay Kết trình bày bảng 9.2 Bảng 9.2 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ chữ Y Tổng số lần vào cánh Lô Tỷ lệ chuyển tiếp (%) Sinh lý 2D 70,49 ± 4,03 38,83 ± 5,91 TMT 2D 56,27 ± 10,60* 41,50 ± 12,55 % giảm so với sinh lý 20,17 Sinh lý 7D 67,85 ± 4,08 35,50 ± 7,50 TMT 7D 62,38 ± 4,76 36,50 ± 5,28 % giảm so với sinh lý 8,06 xxxiii tay Kết bảng 9.2 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D đánh giá test mê lộ chữ Y ngày sau tiêm trimethyltin có tỷ lệ chuyển tiếp giảm 20,17% so với lô chứng sinh lý (p0,05) 9.4.2.2 Ảnh hưởng trimethyltin test mê lộ nước Morris Trong test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đánh giá thông qua thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích - Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ Trong tập có bến đỗ test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ trình bày bảng 9.3 Bảng 9.3 Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ test mê lộ nước Morris Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ (giây) Lô (n=8) Ngày Sinh lý 2D 79,15 ± 12,52 % giảm so với ngày TMT 2D 73,23 ± 13,96 % giảm so với ngày Sinh lý 7D 71,33 ± 15,71 % giảm so với ngày TMT 7D % giảm so với ngày Ngày Ngày 46,40 ± 25,43* 38,13 ± 24,79** 28,97 ± 13,38*** 41,38 51,83 63,40 72,78 ± 18,37 58,37 ± 14,92 62,38 ± 26,57 0,61 20,29 14,82 42,67 ± 17,70* 40,18 ± 18,58** 27,37 ± 22,07** 40,18 70,63 ± 13,96 Ngày 43,67 47,24 ± 14,02* 39,47 ± 14,02** 33,12 44,12 61,63 62,92 ± 11,97 10,92 Kết bảng 9.3 cho thấy, mơ hình gây suy giảm trí nhớ trimethyltin, thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ lô chứng sinh lý 2D lô xxxiv chứng sinh lý 7D ngày 2, giảm có ý nghĩa thống kê so với ngày Trong đó, lơ bệnh TMT 2D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ngày 2, khơng có khác biệt so với ngày (p>0,05) Lơ chứng bệnh TMT 7D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ngày giảm khác biệt so với ngày - Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Trong tập khơng có bến đỗ test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng trimethyltin đánh giá thông qua thời gian chuột lưu lại góc phần tư đích Kết trình bày bảng 9.4 Bảng 9.4 Ảnh hưởng trimethyltin đến thời gian chuột góc phần tư đích test mê lộ nước Morris Lô (n=8) Thời gian góc phần tư đích Tỷ lệ giảm so với (giây) lô chứng sinh lý (%) Sinh lý 2D 32,19 ± 6,22 TMT 2D 20,20 ± 3,08** Sinh lý 7D 25,52 ± 2,16 TMT 7D 21,61 ± 2,88* 37,25 15,32 Kết bảng 9.4 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D đánh giá test mê lộ nước Morris ngày sau tiêm trimethyltin có thời gian chuột góc phần tư đích giảm 37,25% so với lơ chứng sinh lý 2D (p