FILE_20211203_101948_LUẬN-VĂN-TỐT-NGHIỆP-NTAT-1ddsq

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LIPIT TRONG MẨU NƯỚC THẢI Ở NHÀ HÀNG TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: D420201 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ ANH THƯ Mã số sinh viên: 15126138 Niên khóa: 2015-2019 Tháng năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LIPIT TRONG MẨU NƯỚC THẢI Ở NHÀ HÀNG TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực Th.S BẠCH NGỌC MINH NGUYỄN THỊ ANH THƯ Tháng 01 năm 2019 MỤC LỤC Trang Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia có kinh tế đa dạng mau phục hồi, tăng trưởng tốc độ bền vững 6% hai năm 2016-2017 (theo báo THE WORLD & VIETNAM REPORT 10/2/2017) Các vốn đầu tư nước đầu tư vào Việt Nam tăng cao, kéo theo phát triễn ngành công nghiệp, nông nghiệp dịch vụ Cùng với phát triễn ngành cơng nghiệp dịch vụ, giao thoa văn hóa với nước giới làm cho văn hóa ẩm thực nước ta thêm phong phú đa dạng Một lượng lớn nước thải từ nhà hàng, hầu hết có hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt, nhiên hệ thống xử lí nước thải xử lí số nhỏ lượng chất thải dể phân hủy có nước thải, chất thải có kết cấu bền như: dầu, mỡ chất béo , khó phân hủy Tích tụ dầu mỡ ống dẫn thải lâu ngày dẫn đến cố như: gây tắt nghẽn đường cống thoát nước, mùi nồng nặc, bồn chậm nước Có nhiều phương pháp xử lí dầu mỡ nước thải như: xử lí theo phương pháp vật lí sử dụng thiết bị đánh tan mỡ, hút bỏ mỡ xử lí phương pháp hóa học để phá vỡ lớp dầu mỡ xả vào môi trường Tuy rằng, biện pháp hiệu dể tìm kiếm hóa chất, xử lí nhanh lại tốn kém, hợp chất độc hại cho người mơi trường Xử lí nước thải chứa nhiều dầu mỡ nhà hàng, phương pháp sinh học giải pháp mà người hướng đến Để giúp môi trường hơn, thân thiện với môi trường Phương pháp sử dụng vi sinh vật kết hợp với điều kiện nhiệt độ pH, tốc độ dịng chảy khai thác sức mạnh cơng nghệ sinh học môi trường để giải cố dầu mỡ, nước thải chứa nhiều lipit gây có hệ thống nước cách hồn tồn tự nhiên (Trịnh Lê Hùng, 2009) Chính thế, với vốn kiến thức tích lũy được, thơi thúc thực đề tài nghiên cứu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải lipit nước thải nhà hàng Đánh giá tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân giải lipit nước thải tốt 1.3 Nội dung thực Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải lipit từ mẫu nước thải Thí nghiệm 2: Thử nghiệm đặc tính sinh hóa chủng vi sinh vật phân lập Thí nghiệm 3: Thử nghiệm khả phân giải lipit chủng vi sinh vật + Thí nghiệm 3.1: Định tính số mơi trường TBA + Thí nghiệm 3.2: Định lượng đo quang phổ với chất p - NPP máy đo OD Thí nghiệm 4: Chủng vi sinh vật sinh lipase tốt định danh PCR Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan 2.1.1 Các thành phần nước thải nhà hàng Với tính chất đặc thù riêng nên nước thải nhà hàng chứa số thành phần ô nhiễm giống với nước thải sinh hoạt tỉ lệ hàm lượng chất có chênh lệch đáng kể như: chất rắn lơ lửng, amoniac, chất hữu tan, chất tẩy rửa, dầu mỡ (chiếm tỉ lệ lớn nhất) nhiều loại vi khuẩn gây bệnh hẳn (theo QCVN 14:2008/BTNMT) 2.1.2 Giới thiệu Lipit 2.1.2.1 Khái niệm Lipit Lipit nhóm chất hữu đặc trưng có mặt phân tử chúng chức este axit béo cao phân tử Chúng có độ nhớt cao, khơng tan nước, tan dung môi hữu ether, chlorphom, benzene, rượu nóng Giống carbonhydrate, lipit tạo nên từ C, H O chúng chứa nguyên tố khác P N Chúng khác với carbonhydrate chỗ chứa O với tỉ lệ Lipit dù dạng nhìn thấy mỡ động vật, dầu thực vật, bơ, macgarin… dạng khơng nhìn thấy thành phần số thực phẩm thịt, trứng, sữa, phomat… có vai trò quan trọng Thành phần axit béo dầu thực vật chủ yếu axit béo không no axit oleic (C18:1), axit linoleic (C18:2) axit linolenic (C18:3) Lipit gồm lipit thực vật lipit động vật cấu tạo chủ yếu từ triglyxerit (9095%) Về cấu tạo hóa học chúng este rượu ba chức glyxerin axit béo 2.1.2.2 Phân loại Lipit Tuỳ thuộc vào thành phần, cấu tạo vai trò thể, lipit chia thành: - Lipit đơn giản: + Trong thành phần có rượu liên kết este với axit béo + Glycerid: trieste glycerin axit béo + Xerid(sáp): este rượu mạch thẳng axit béo + Sterid (cholesterin): este axit béo rượu đa vòng đặc biệt (các sterol) - Lipit phức tạp + Trong thành phần, rượu axit béo cịn có chất khác + Phospholipid: este rượu đa chức với axit béo cao có H 3PO4, base nitơ làm nhóm phụ bổ sung + Glucolipid: tạo thành từ rượu đơn chức, axit béo cao glucid (thường galactose) 2.1.2.3 Phân bố Lipit Động vật: nguồn lipit động vật, có mặt hầu hết thực phẩm làm từ động vật Thực vật: nguồn lipit thực vật Hàm lượng lipit hạt lạc 44,5% 2.2 Giới thiệu enzyme Lipase Lipases (triacyl glycerol acyl hydrolases): enzym có tính xúc tác linh hoạt sử dụng với nhiều mục đích khác chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da biến đổi cấu hình khơng gian số hợp chất hữu từ dạng không hoạt động sang hoạt động Lipase có nhiều loại thực vật, hiểu biết lipase thực vật hạn chế so với lipase từ động vật hay vi sinh vật Lipase thực vật enzym thủy phân liên kết ester triacylglycerol dự trữ hạt đặc biệt loại hạt chứa dầu (như hạt ngô, dừa, bông, đậu phộng), triacylglycerol nguồn lượng cung cấp cho trình nảy mầm hạt Các lipase thực vật nghiên cứu tinh lipases từ ngô, cải, đậu Hiện lipase thực vật ứng dụng chuyển đổi sinh học lipit Lipase tuyến tụy enzym động vật biết đến sớm trở thành mơ hình cho nghiên cứu lipase động vật sau Lipase chiết xuất từ tụy lợn sử dụng từ lâu enzym kĩ thuật sử dụng y học Các lipase sữa biểu hoạt tính xúc tác thủy phân glycerol chứa gốc acyl (MAG) Mặc dù nghiên cứu nhiều lipase từ động vật thực vật không sở hữu số đặc điểm cần thiết q trình cơng nghiệp lipase thu từ nhiều vi sinh vật khác nấm mốc, nấm men vi khuẩn Nhiều loài chi nấm Aspergillus, Candida, Humicola, Mucor, Penicillium, Rhizopus Yarrowia sinh lipase mạnh, nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực khác Hầu hết lipase vi khuẩn có nguồn gốc từ Bacillus spp Một số khác từ chi Acinetobacter, Alcaligenes, Burkholderia, Chromobacterium, Pseudomonas Với đa dạng lớn đặc tính, khả xúc tác hình thành nhiều liên kết ester khác nhau, lipase vi sinh vật đối tượng hấp dẫn cho ứng dụng công nghiệp Nỗ lực lớn thực để đưa enzym hoạt động điều kiện pH kiềm vào nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, đặc biệt công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, cơng nghệ xử lí mơi trường 2.2.1 Tính chất enzyme Lipase Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein: sản xuất tế bào sống (thực vật, động vật, vi sinh vật); enzyme xúc tác cho phản ứng sinh học; có khả xúc tác bên bên tế bào; cường độ xúc tác mạnh; điều kiện xúc tác ơn hịa; phản ứng enzyme có khả điều khiển Khả thủy phân lipit: lipase phân nhỏ lipit hệ tiêu hóa người, biến đổi triglycerde dầu ăn thành monoglyceride axit béo tự Cơ chế: chúng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết không cắt đứt ba liên kết este lúc, trình xúc tác lipase thường chậm so với trình xúc tác enzyme khác protease hay amylase 2.2.2 Phân bố enzyme Lipase Có nhiều loại enzyme lipase tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau: pancreatic lipase; lipase từ vi sinh vật, loại vi sinh vật sử dụng sản xuất lipase theo quy mô công nghiệp nấm sợi 2.2.3 Ứng dụng Lipase Lipase từ vi khuẩn nấm có vai trị quan trọng việc lên men phô mai; lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride giao diện chất nước ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực công nghiệp bột giặt, sữa, chế biến dầu Ứng dụng sản xuất chế phẩm enzyme xử lí nước thải; hoạt tính lipase áp dụng để loại bỏ vết bẩn dạng dầu Ngoài sử dụng cho sản xuất phô mai cứng mềm tạo cấu trúc mịn, mà giữ hương vị ban đầu sản phẩm Lipase xúc tác phản ứng sinh học linh hoạt thể nhiều phản ứng biến đổi sinh học: thủy phân, nội ester hoá, ester hoá Lipase hoạt động điều kiện dễ dàng Chúng phản ứng dung mơi hữu khác thường thể tính chọn lọc qua loại phản ứng Lipase thay tốt cho nhiều kỹ thuật hữu cổ điển việc biến đổi phân tử phức tạp Chúng có nhiều đặc tính xúc tác sinh học quý Khi so sánh với công nghệ truyền thống, việc sử dụng lipase giảm chi phí luợng độc chất sản phẩm (Jansen ctv, 1996) Các lipase ưa nhiệt sử dụng rộng rãi công nghệ tẩy rửa Nhiều loại vết thực phẩm huyết người có chứa triglyceride lipase thủy phân thành axit béo, monoglyceride diglyceride Các sản phẩm dễ dàng loại khỏi vật liệu (vải, quần, áo, gỗ) chất triglyceride chưa thủy phân (Fuji ctv, 1986) 2.2.3.1 Ứng dụng lipase công nghiệp thực phẩm Lipase trở thành phần quan trọng công nghiệp thực phẩm đại (Jäeger ctv., 1994; Kirk ctv., 2002; Jäeger Eggert; 2002).Việc sử dụng lipase để cải thiện q trình chế biến hố học sản xuất thực phẩm phát triển năm gần Yoneda ctv (1996) dùng lipase Pseudomonas ứng dụng trình chế biến thực phẩm sản xuất dầu ăn Alcoholysis dầu gan cá tuyết để sản xuất omega-3 axit béo để chống lại hình thành cholesterol Điều khám phá dùng lipase Pseudomonas (Zuyi Ward 1993) Một vài loài vi khuẩn sản sinh ester tạo mùi ứng dụng công nghiệp phô mai Sản phẩm mùi lipase vi khuẩn Staphylococcus warneri Staphylococcus xylosus miêu tả Talon ctv (1996) Lipase vi khuẩn C.viscosum giúp cho việc tích trữ hương vị tốt tích trữ vịng 10 chất thủy phân enzym thủy phân, có lipase tạo lượng lớn sản phẩm đồng phân, điều ứng dụng tạo chiral để tổng hợp dược chất đặc biệt Akita ctv, 1997 trình bày động học enzym thủy phân không tan nước cách dùng vi khuẩn Pseudomonas sp cố định Lipase sản sinh nhân trung gian để tổng hợp kháng sinh (-) indolmycin Một phương pháp phát triển Jimenez ctv (1997) để tổng hợp methyl (R)- (S)-2- tetradecyloxiranecarboxylate xúc tác lipase Pseudomopnas sp., đồng phân lập thể sử dụng thuốc chống bệnh tiểu đường kháng sinh Lipase sử dụng để xúc tác ester hoá tinh bột sắn làm chất mang dược chất làm vật liệu điều trị gãy xương (Rajan ctv, 2008) 2.2.3.7 Ứng dụng lipase nơng dược Q trình tạo loại nông dược (thuốc diệt côn trùng, thuốc trừ cỏ, thuốc trừ nấm) dùng lipase làm xúc tác (Pandey ctv, 1999; Jian ctv, 2005) Dưới xúc tác lipase, nông dược sản phẩm hỗn hợp của alcohol carboxylic ester, sản phẩm có tính chất quang (Yamada ctv., 1990; Ghanem Enein 2004) Akita ctv (1995) miêu tả việc tổng hợp đồng phân quang học mức độ cao hai chiral trung tâm, chất cải biến thành chiral trung gian cho việc tổng hợp hợp chất có hoạt tính trừ sâu mạnh: nikkomycin-B Mitsuda ctv (1990) có báo cáo việc dùng lipase từ Achromobacter để thủy phân liên kết ester racemic a-cyano-3-phenoxybenzyl alcohol (CPBA) tạo thành sản phẩm (S)CPBA, hoạt chất trừ sâu đồng phân lập thể 2.2.3.8 Ứng dụng lipase sản xuất biodiesel Một dạng lượng từ tự nhiên nghiên cứu sử dụng cho động đốt gọi biodiesel Biodiesel biến đổi từ loại dầu thực vật 13 phế phẩm nông nghiệp khác (Park ctv, 2008) Biodiesel giảm thiểu ô nhiễm sulfur oxit SO2 (Jäeger ctv, 2002) Sản xuất biodiesel dùng lipase xúc tác miêu tả lần Mittlebach (1990) Mittlebach lipase P.fluorescens dùng để sản xuất biodiesel từ alcohol hố dầu hướng dương thích hợp so với lipase từ Candida sp Mucor miehei Sự alcohol hố thực có diện dung mơi (petroleum ether) khơng có dung mơi dùng loại alcohol tương ứng có khơng thêm nước Tiếp sau đó, nghiên cứu tập trung lipase khác nhau, nguyên liệu triglyceride khác nhau, alcohol khác điều kiện thí nghiệm khác (nhiệt độ, hàm lượng nước, tỷ lệ hoá học chất, enzym dung môi dùng) Việc biến đổi dầu ăn, mỡ cá basa phụ phẩm ngành chăn nuôi thủy sản thành methyl, alkyl ester chuỗi alcohol ester ngắn lipase xúc tác phản ứng chuyển vị ester dung môi hữu (Fukuda ctv, 2001; Haas ctv, 2005) Tuy nhiên, việc ứng dụng quy mơ cơng nghiệp gặp khó khăn chi phí cao so với phương pháp luyện dầu nhiệt độ cao 2.3 Các chủng vi sinh vật có khả phân giải Lipase 2.3.1 Giới thiệu Bacillus Theo khóa phân loại Bergey (1994) Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus sp Bacillus sp chi gồm vi khuẩn hình que có kích thước 0,5 – 2,5 x 1,2 -10 µm, tế bào thường xếp thành cặp chuỗi, đầu trịn hay vng Tất Bacillus sp hình thành nội bào tử, nội bào tử có hình ovan chịu điều kiện bất lợi, hiếu khí kỵ khí tùy nghi (Lê Xuân Phương, 2001) 14 Hầu hết chủng có khả di động, catalas dương tính, nồng độ chịu đựng muối rộng, tồn điều kiện bất lợi khoảng thời gian dài Bacillus sp phổ biến phân lập từ nhiều nguồn khác 2.3.2 Giới thiệu Pseudomonas Theo khóa phân loại Bergey (1994) Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas sp Pseudomonas sp chi vi khuẩn xuất nơi môi trường Sự biến dưỡng dễ thay đổi linh động chúng làm cho chúng sống nhiều mơi trường khác nước, đất, động vật Trong số loài Pseudomonas sp này, có lồi tiêu biểu sử dụng cơng nghệ sinh học Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi đầu khơng có bào tử Các đặc điểm sinh lý dị dưỡng, không lên men, linh hoạt dinh dưỡng, không quang hợp cố định nitrogen 2.4 Các cơng trình nghiên cứu nước Các nghiên cứu nước: Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyễn Thị Thảo, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng 2013 Phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase từ nước thải khảo sát hoạt tính 102 chủng Pseudomonas Các nghiên cứu nước: Lipase từ chủng vi khuẩn P.medocina (Lumafast ®) Pseudomonas alcaligenes (Lipomax®) sản xuất bổ sung vào chất tẩy rửa công ty Genencor international USA (Jäeger ctv, 1994; Reetz Jäeger 1998) 15 Lipase sử dụng để loại bỏ chất chứa loại phế thải dầu ôliu chất phế thải từ nhà máy dầu (Vitolo ctv, 1998) Yoneda ctv, (1996) dùng lipase Pseudomonas ứng dụng trình chế biến thực phẩm sản xuất dầu ăn Alcoholysis dầu gan cá tuyết để sản xuất omega-3 acxit béo để chống lại hình thành cholesterol Điều khám phá dùng lipase Pseudomonas (Zuyi Ward 1993) Một vài loài vi khuẩn sản sinh ester tạo mùi ứng dụng công nghiệp phô mai Sản phẩm mùi lipase vi khuẩn Staphylococcus warneri Staphylococcus xylosus miêu tả Talon ctv, (1996) 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Đề tài thực từ tháng đến tháng năm 2019 Các thí nghiệm thực phịng Cơng nghệ Biến đổi Sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới số 9/621 xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nước thải thu cuối đường xả thải bể lắng nước thải nhà hàng 3.2.2 Thiết bị dụng cụ hóa chất sử dụng 3.2.2.1 Thiết bị dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, erlen, que cấy vịng, que cấy móc, que cấy trang, máy đo pH, máy votex, lò viba Ichiban, máy lắc Shaker, tủ sấy Sanyo, nồi hấp ALP, tủ ấm Binder, kính hiển vi Leica DMLS, cân phân tích Precisa, tủ cấy Telstar, máy đo OD Lamotte, máy ly tâm số dụng cụ thí nghiệm khác 3.2.2.2 Hóa chất sử dụng Peptone, cao nấm men, NaCl, cồn, agar, nước cất, tributyrin, NH 4H2PO4,K2HPO4, MgSO4.7H2O, Na3C6H5O7, Brom Thymol Blue, H202, Violet, sagaphin, lugol, Kocvas, acetonitrile, isopropanol, tris HCl, p-nitrolphenyl (p-NPP), p-nitrophenol (p-NP), dầu olive, đệm phosphat 3.2.3 Môi trường Môi trường Luria Bertami (LB) nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Nồng độ (g/l) Peptone 10 Cao nấm men Agar 15-20 NaCl 10 (Theo SBC Scientific) 17 Môi trường Tributyrin (TBA) phân lập vi khuẩn Thành phần Nồng độ (g/l) Peptone Tributyrin 10 Cao nấm men Agar 15 pH 7.5 (Theo SIGMA-ALORICH is now Merck) Môi trường NB nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Nồng độ (g/l) Peptone Cao nấm men NaCl (Theo SIGMA-ALORICH is now Merck) 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải Lipit Nước thải sau thu, tiến hành lắc tăng sinh vi sinh vật muối sinh lý 30-60 phút Sau đó, mẫu pha lỗng theo dãy thập phân cách dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý hấp khử trùng, trộn mẫu thật kĩ, dung dịch có nồng độ 10 -1 Tiếp tục chuyển ml mẫu từ nồng độ 10-1sang ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng thứ 2, trộn mẫu thật kĩ, dung dịch có nồng độ 10-2 Tiếp tục đến 10-3, 10-4, 10-5 Đổ môi trường phân lập TBA vào đĩa peptri (khoảng 15 ml), để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn Dùng pipet hút 0,1ml mẫu độ pha loãng (mỗi độ pha loãng cấy đĩa) Dùng que gạt thủy tinh khử trùng cách nhúng vào dung dịch ethanol đốt lửa đèn cồn, để nguội que cấy, trãi mẫu cho dàn bề mặt môi trường Ghi nhãn lên đĩa peptri (tên mẫu, ngày cấy, nồng độ…) ủ mẫu 30 độ C Quan sát sau 24h, 48h, 72h Bắt khuẩn lạc đơn có vịng phân giải ni cấy mơi trường LB để định tính đặc tính sinh hóa 3.3.2 Xác định đặc tính sinh hóa 3.3.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc nhuộm Gram 18 Theo Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009 Nguyên tắc: nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo peptidoglycan có màu tím, cịn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng (do có peptidoglycan hơn) bao bọc màng mỏng có màu hồng Cách tiến hành: cho giọt nước cất lên phiến kính sạch, dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn (sau cấy 24 giờ), dàn để khô tự nhiên Hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn - lần để cố định tế bào Phủ hoàn toàn vết bôi với thuốc nhuộm crystal violet, để yên 30 giây sau nhẹ nhàng rửa trơi thuốc nhuộm nước, thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod 30 giây, rửa nước, thấm khơ Giữ phiến kính góc nghiên nhỏ cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo Ngay rửa vết bơi lại với nước Vết bơi dày cần phải khử màu lâu Tuy nhiên thời gian để vết bôi tiếp xúc với cồn không nên lâu giây Thời gian khử màu bước đóng vai trị quan trọng định kết q trình nhuộm Phủ hồn tồn vết bơi với safranin để yên 30 giây, rửa lại với nước Thấm khơ phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khơ hồn tồn, quan sát kính hiển vi với vật kính dầu 3.3.2.2 Thử nghiệm khả di động Theo Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009 Nguyên tắc: vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi tiêm mao có nhiều vi khuẩn hình que, hình cầu Khả di động đặc điểm dùng để phân biệt vi sinh vật, khả quan sát dựa vào tăng trưởng di động vi sinh vật vào bên môi trường thạch mềm Cách thực hiện: chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường LB - Agar (0,5%) cao - cm, hấp khử trùng Dùng que cấy thẳng chấm vào dịch nuôi vi khuẩn lắc tăng sinh 24 đâm thẳng que cấy xuyên vào tâm môi trường ống nghiệm tới độ sâu khoảng cm Ủ 37 0C 24 quan sát 19 Nếu vi khuẩn mọc loang theo đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả di động ngược lại 3.3.2.3 Thử nghiệm khả sử dụng đường Theo Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009 Sinh khí (H2S) mơi trường TSI (1% lactose, 0.1% glucose, 1% sucrose) Nguyên tắc: khả vi sinh vật đánh giá thông qua thay đổi màu pH môi trường bề mặt bên môi trường ống thạch nghiêng Tiến hành: cấy thạch nghiêng, sau cấy đâm sâu vào chân thạch Ủ nhiệt độ 37 độ C 24h Đọc kết quả: - Đáy ống nghiệm: vàng (glucose dương tính), màu đỏ/khơng đổi màu (glucose âm tính), màu đen (sinh H2S), vỡ thạch (sinh từ glucose) - Mặt nghiêng: vàng (lactose sucrose dương tính), đỏ/khơng đổi màu (lactose sucrose âm tính) 3.3.2.4 Thử nghiệm catalas Các vi sinh vật hiếu khí kị khí tùy nghi chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome có enzyme catalase, có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo H 2O2 Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí Cách tiến hành: dung dịch H2O2 3% giữ tròn tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng Dung dịch đệm phosphate pH 7,0 Nhỏ trực tiếp 1ml H 2O2 3% lên sinh khối chủng bề mặt thạch nghiêng Đọc kết quả: có tượng sủi bọt khí khí O2 tạo dương tính Ngược lại khơng có tượng sủi bọt âm tính 3.3.2.5 Thử nghiệm khả chuyển hóa citrate Theo Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009 Nguyên tắc: Khi vi sinh vật chuyển hóa citrate, muối ammonium bị chuyển hóa thành ammoniac làm kiềm hóa mơi trường Chất thị xanh bromthymol môi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh nước biển pH môi trường 20 7,6 Vi sinh vật có khả sử dụng citrate nguồn carbon có khả sử dụng muối ammonium làm nguồn nitơ sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm Thực hiện: Cấy vi khuẩn đường thẳng đứng môi trường Citrat Simmons thạch nghiêng, ủ 35-37 độ C 24 Đọc kết quả: Nếu thạch nghiêng chuyển từ xanh sang màu xanh nước biễn khơng chuyển màu mà có khuẩn lạc mọc xem dương tính (cần quan sát thêm) Ngược lại không chuyển màu (màu xanh lá) âm tính 3.3.2.6 Thử nghiệm khả sinh indole Nguyên tắc: phát khả oxi hóa tryptophan thành dạng indol, skatole (methyl indole) indole-acetate Thực hiện: dùng pipet hút 1ml dịch khuẩn cho vào 9ml môi trường Peptone Broth Sau 24h nhỏ 3-5 giọt thuốc thử kovac vào ống nghiệm quan sát Đọc kết quả: Nếu xuất vòng đỏ cánh sen lên bề mặt môi trường (do indol kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde thuốc thử kovacs) dương tính Ngược lại xuất màu vàng (màu thuốc thử kovacs) màu âm tính Với chủng indol chậm thử sau 48 3.3.2.7 Thử nghiệm khả sinh bào tử Theo Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009 Đổ đĩa môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB, để yên cho đơng đặc hồn tồn Sau đó, dùng pipet hút 10 ml dịch khuẩn cho vào ống nghiệm, đun nước sơi 45 phút Để nguội, dùng que cấy vịng thực kỹ thuật cấy ria dịch khuẩn lên môi trường phân lập LB, ủ nhiệt độ 37 độ C Tiến hành quan sat sau 48 Đọc kết quả: xuất khuẩn lạc môi trương LB vi khuẩn có khả sinh bào tử Ngược lại, vi khuẩn khơng có khả sinh bào tử, 3.3.2.8 Thử nghiệm oxidase Nguyên tắc: phát vi sinh vật có hệ enzym oxidase (hệ cytochrom C) Thực hiện: đổ môi trường nuôi cấy LB vào đĩa peptri để n cho đơng đặc hồn tồn, dùng que cấy vịng cấy ria dịch khuẩn phân lập lên môi trường LB Dùng que tăm hấp khử trùng, lấy khuẩn lạc đơn đặt lên giấy thấm, sau nhỏ thuốc thử 21 TMDP (0,1% N,N,N,N Tetramethyl-p-phenylenediamine) lên giấy thấm chứa khuẩn lạc đơn Quan sát sau 30 giây Đọc kết quả: sinh khối chuyển sang màu xanh dương dương tính, ngược lại sinh khối khơng đổi màu âm tính 3.3.2.9 Thử nghiệm khả chịu mặn vi sinh vật Nguyên tắc: thử nghiệm khả sinh trưởng vi sinh vật môi trường chứa nồng độ muối khác Thực hiện: cấy dịng vi sinh vật vào 100 ml mơi trường LB lỏng Lắc tăng sinh 48 Hút 1ml dịch khuẩn vào bình chứa nồng độ muối 0%, 5%, 10%, 15% Lắc tăng sinh 48 theo phương pháp Kobayashi (2004) Sau tiến hành đo OD bước sóng 600nm Phân tích kết dựa so sánh giá trị OD nồng độ muối để đưa kết luận khả tồn phát triển chủng nồng độ muối khác 3.3.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân giải lipit tốt 3.3.3.1 Định tính khả phân giải lipit môi trường TBA Cấy giống vi khuẩn từ ống nghiệm vào môi trường LB lỏng lắc 48 Đổ đĩa môi trường TBA, để yên cho môi trường đơng đặc hồn tồn, đặt giấy lọc trịn, đường kính 1,5 cm hấp khử trùng vào đĩa môi trường TBA Dùng pipet hút 0,004 ml dịch khuẩn sau lắc tăng sinh vào lên giấy lọc, sau cho dịch khuẩn khơng tràn ngồi mơi trường Sau đo đường kính vịng phân giải sau 48 Cách đo vòng phân giải: Vòng phân giải (mm) = Đường kính vịng phân giải (mm) – Đường kính Halo (mm) 3.3.3.2 Định lượng phương pháp dựng đường chuẩn * Môi trường nuôi cấy Môi trường kiểm tra khả sinh lipase vi sinh vật: dầu olive nhũ hóa đệm phosphat pH = theo tỉ lệ 1:1 ( 10ml dầu olive vào 10 ml phosphat), sau hút ml dầu olive nhũ hóa vào 100 ml môi trường NB Dùng pipet hút ml dịch 22 khuẩn vào môi trường NB chứa 0,5% dầu olive nhũ hóa Lắc tăng sinh 48 * Dựng đường chuẩn Sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ với chất p–nitrolphenyl palmitate (p-NPP) bước sóng OD 410 nm Ngun lí: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân chất p - nitrophenol palmitat (pNPP) tạo p - nitrophenol (p-NP) biểu màu vàng đặc trưng môi trường pH kiềm Hoạt độ lipase xác định cách đo cường độ màu dung dịch chứa p-NP máy UVIS bước sóng λ = 410 nm Sau lập đồ thị chuẩn p-NP, đồ thị chuẩn p-NP tiến hành xây dựng dựa mối tương quan hàm lượng p-NP độ hấp thụ quang bước sóng 410 nm Thực hiện: Pha dung dịch p-NP 1µmol/ml (dung dịch A) Dung dịch p-NP ban đầu có nồng độ 10 mM pha loãng 100 lần đệm Tris HCl (pH 9) để tạo nên dung dịch có nồng độ p-NP 1µmol/ml.Dùng dung dịch p-NP 1µmol/ml pha loãng tiếp đệm Tris - HCl pH = 9,0 thành nồng độ khác nhau: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; (µmol/ml) Sau đó, pha chất p-NPP (0,2 mM) (dung dịch B) Cân 0,03 g p-NPP hòa tan ml dung môi bao gồm: acetonitrile –isopropanol theo tỉ lệ : (v/v), lắc cho chất tan hết, ta dung dịch C.Lấy dung dịch C (gồm p-NP, acetonitrile, isopropanol) pha vào dung dịch đệm Tris HCl (50 mM, pH 9) theo tỉ lệ : 19 (v/v), ta dung dịch chất p-NPP (0,2 mM) Lưu ý: Chỉ cho dung dịch C vào dung dịch đệm mà không làm ngược lại để tránh tạo váng.Tiến hành phản ứng phản ứng thực 35 oC, 10 phút Dùng 100 µl dung dịch A nồng độ hòa tan vào 1ml dung dịch B, đun sôi 10 phút, để nguội nhiệt độ phòng, cho vào thêm ml H2O khử ion, li tâm đo OD 410 nm Lập đường chuẩn:Các số OD đo nồng độ chất khác sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn tương quan hai giá trị Mức độ tin cậy đồ thị thể qua sai số ngẫu nhiên R2, * Đo 0,1 ml dịch sau 48h nuôi cấy đo quang phổ bước sóng 410 nm 23 3.3.3.3 Cách tính hoạt độ lipase Một đơn vị hoạt độ lipase (U) xác định lượng enzym có khả chuyển hóa tạo micromol axit béo thời gian phút Hoạt độ lipase ml dịch tính theo cơng thức: Hoạtđộlipase(UI/ml) = Trong đó: X: lượng chất p - NPP sau thay vào đường chuẩn (µmol/ml) a: lượng dịch canh trường tham gia phản ứng (ml) t: thời gian dịch canh trường phân giải chất p - NPP (phút) 3.3.3.4 Định danh sinh học phân tử Các chủng vi sinh vật định danh phương pháp PCR giải trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn ( Nguyễn Lân Dũng ctv, 2009) 3.4 Phương pháp xử lí số liệu Tính tốn dựa phần mềm Microsoft Office Excel 2010 phần mềm thống kê MSTATC 24 Chương KẾT QUẢ DỰ KIẾN Phân lập định danh chủng vi sinh vật có khả phân giải lipit nước thải nhà hàng 25