Nghiên cứu áp dụng phương pháp điện di trên gel gradient biến tính để kiểm định thành phần vi khuẩn nhằm phát triển quy trình mới trong đánh giá chất lượng chế phẩm men vi sinh

Trong nghiên cứu này, thử nghiệm việc áp dụng kỹ thuật DGGE để kiểm tra chất lượng 10 chế phẩm men vi sinh phổ biến trên thị trường. Tập trung vào các chế phẩm chỉ chứa vi khuẩn, vốn chiếm đa số trên thị trường. Trước hết, DNA tổng số của vi khuẩn trong các chế phẩm được tách chiết để nhân gen đoạn 550 bp nằm trong trình tự 16S rDNA.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL GRADIENT BIẾN TÍNH ĐỂ KIỂM ĐỊNH THÀNH PHẦN VI KHUẨN NHẰM PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH MỚI TRONG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM MEN VI SINH Trần Mỹ Hạnh, Cao Thị Dung, Trần Thị Thanh Huyền, Phạm Thế Hải* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: phamthehai@vnu.edu.vn Ngày nhận bài: 19.12.2018 Ngày nhận đăng: 25.7.2019 TÓM TẮT Chất lượng men vi sinh định thành phần vi sinh vật có mặt sản phẩm đó, kiểm định thơng qua phân tích đặc điểm Việc sử dụng kỹ thuật điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – DGGE) cho phép phát vi sinh vật thông qua băng đặc trưng tương ứng điện di, coi "mã vạch" vi sinh vật Nguyên tắc “mã vạch” cho thấy tiềm ứng dụng kỹ thuật DGGE để kiểm tra chế phẩm men vi sinh có hay khơng có loại vi sinh vật cơng bố, từ đánh giá chế phẩm có đạt tiêu chuẩn hay khơng Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi thử nghiệm việc áp dụng kỹ thuật DGGE để kiểm tra chất lượng 10 chế phẩm men vi sinh phổ biến thị trường Chúng tập trung vào chế phẩm chứa vi khuẩn, vốn chiếm đa số thị trường Trước hết, DNA tổng số vi khuẩn chế phẩm tách chiết để nhân gen đoạn 550 bp nằm trình tự 16S rDNA Sau đó, sản phẩm nhân gen phân tích DGGE với gradient biến tính từ 30% đến 60% Kết cho thấy thành phần vi sinh vật 7/10 sản phẩm giống với công bố nhãn giống với kết phân lập phương pháp nuôi cấy truyền thống Như vậy, nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng kỹ thuật DGGE đánh giá chất lượng men vi sinh Từ khóa: 16S rDNA, điện di gel gradient biến tính (DGGE), men vi sinh (probiotic), phân lập vi sinh vật, tách chiết DNA GIỚI THIỆU Các chế phẩm vi sinh ngày sử dụng nhiều lĩnh vực đời sống, góp phần cải thiện chất lượng sống người (Levin et al., 2011; Ravi et al., 2014) Nếu cách 10 năm, Việt Nam xuất chế phẩm vi sinh EM xuất xứ từ Nhật Bản thị trường nước xuất vô số sản phẩm vi sinh khác nhà khoa học sở nước nghiên cứu, sản xuất Trong số chế phẩm vi sinh phổ biến, men vi sinh sản phẩm tiêu thụ rộng rãi đa dạng mặt chủng loại (Ravi et al., 2014) Nhiều nhà sản xuất chạy đua để tạo sản phẩm men vi sinh dạng khác nhau, gồm dạng viên, dạng lỏng hay dạng bột loại men vi sinh dễ sản xuất tuân theo quy chuẩn chất lượng nghiêm ngặt Các sản phẩm cấp phép Bộ Y tế sản phẩm hỗ trợ điều trị với công dụng công bố từ việc ngăn ngừa tiêu chảy, ngộ độc thực phẩm kích thích hệ miễn dịch Một số thông tin sản phẩm men vi sinh bắt buộc phải công bố nhãn bao gồm tên loài chủng men vi sinh số lượng tế bào sống (CFU) gram chế phẩm mà khơng cần tên chủng xác đặc tính probiotics (Thơng tư 43/2014/TT-BYT) Hơn nữa, năm 2011, phương tiện thông tin đại chúng thông báo khoảng 50% sản phẩm men vi sinh thị trường Việt Nam không đủ số lượng vi sinh vật cịn sống, chí khơng có vi sinh vật sống (Nguyễn Thị Huyền et al., 2014) Vì vậy, để giúp người tiêu dùng chọn lựa chế phẩm men vi sinh có chất lượng đảm bảo thị trường, việc xây dựng quy trình đánh giá hiệu xác thành phần vi sinh vật chế phẩm cần thiết Cho đến nay, việc xác định tồn loại vi sinh vật thường dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống môi trường đặc trưng loài 577 Trần Mỹ Hạnh et al muốn xác định, sau dùng phương pháp thích hợp để định danh soi kính hiển vi, test sinh hóa (API kit) phân tích trình tự 16S rDNA (Hanna et al., 2004) Trong nhiều trường hợp việc xác nhận vi sinh vật có tên nhãn sản phẩm phương pháp nuôi cấy phức tạp, đặc biệt với số vi khuẩn Bifidobacterium (Yaeshima et al., 1996) Hơn nữa, việc định dạng vi sinh vật xác dựa quan sát hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, kiểu bắt màu thuốc nhuộm, đặc tính sinh lý sinh hóa… tốn nhiều thời gian khơng thuận tiện Một kỹ thuật sinh học phân tử đại phổ biến để đánh giá thành phần tập hợp vi sinh vật quần xã không qua nuôi cấy kỹ thuật PCR-DGGE (Muyzer et al., 1999) Đối tượng phân tích kỹ thuật DNA ribosome vi sinh vật, dựa việc di chuyển phân đoạn 16S rDNA khuếch đại gel polyacrylamide có chứa chất biến tính với nồng độ thay đổi theo gradient (Valaskova et al., 2009 and Bo Deng et al., 2012) Trong DGGE, phân đoạn DNA giống chiều dài khác trình tự cặp base phân tách; phân đoạn DNA với trình tự nhiều GC bị biến tính muộn gel gradient chất biến tính di chuyển xa gel điện di (Muyzer et al., 1993) Vì vậy, ngun tắc, rDNA lồi vi sinh vật với trình tự đặc trưng có vị trí băng đặc trưng gel DGGE Kỹ thuật cho phép xác định vi sinh vật phân lập nuôi cấy Như vậy, việc áp dụng DGGE việc đánh giá thành phần chế phẩm men vi sinh cho kết xác thời gian hợp lý, hứa hẹn hiệu cao việc sử dụng phương pháp truyền thống Chính từ nhu cầu thực tiễn việc kiểm soát chất lượng chế phẩm men vi sinh tính hiệu phương pháp điện di gel gradient biến tính, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục đích tìm hiểu khả ứng dụng phương pháp DGGE việc đánh giá chế phẩm vi sinh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Các mẫu men vi sinh (chứa vi khuẩn, 15 mẫu) mua cách ngẫu nhiên hiệu thuốc kí hiệu q trình thực nghiên cứu Các chủng chuẩn: Bacillus clausii B.cl (BC); Bacillus subtilis VTCC-A-275 (BS); Bifidobacterium lactis Bf (Bi); Lactobacillus acidophilus VTCC-A-871(LA); 578 Lactobacillus plantarum VTCC-A-1995(LP); Streptococcus faecalis T13.3 (ST) mua Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC) để làm dấu chuẩn xác định thành phần loài DGGE Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số từ mẫu men vi sinh DNA tổng số chiết xuất trực tiếp từ sản phẩm men vi sinh, sử dụng ANAPURE DNA MINI KIT hãng ANABIO - Việt Nam theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm tách chiết DNA kiểm tra máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 0,7% dung dịch TAE 1x với hiệu điện 90V, thời gian 25 phút Sau điện di, gel nhuộm dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) 20 phút, sau rửa nước chụp ảnh tia UV máy GelDoc (BioRad, Mỹ) Khuếch đại phân đoạn 16S rDNA phản ứng PCR DNA thu từ mẫu men vi sinh đưa vào chạy PCR máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) với mục đích khuếch đại 16S rDNA (1500 bp) cặp mồi sau (Muyzer 1999): fD1 (5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′, mồi xuôi) rP1 (5’ACGGTTACCTTGTTACGACTT3’, ngược) mồi Sản phẩm PCR kiểm tra máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 0,7% dung dịch TAE 1x với hiệu điện 90V thời gian 25 phút, sau nhuộm với dung dịch ethidium bromide 20 phút quan sát máy soi gel GelDoc (BioRad, Mỹ) Sau nhân đoạn 16S rDNA mẫu thành công, 16S rDNA tiếp tục sử dụng làm khuôn nhằm khuếch đại vùng V3-V5 (550 bp) cặp mồi pGM5FGC (với kẹp GC thêm vào) (5’ CCTACGGGAGGCAGCAG 3’, mồi xuôi) p907R (5’ CCGTCAATTCCTTTRAGTTT 3’, mồi ngược) (Lopez et al., 2003) để phục vụ cho q trình phân tích gel DGGE Kẹp GC (CGC CCG CCG CGC GCG GGG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) gắn vào đầu 5’ đoạn mồi GM5FGC để tạo tính ổn định việc phân tách sản phẩm PCR gel điện di biến tính Sản phẩm PCR sau kiểm tra điện di gel agarose 0,7% đệm TAE 1x 80V, 30 phút Điện di gel gradient biến tính DGGE Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 Sản phẩm 16S rDNA (550 bp), sau phân tích phương pháp điện di DGGE Quá trình điện di tiến hành gel polyacrylamide 40% với gradient biến tính urea/formamide từ 30% đến 60% Quá trình điện di thực điện di DGGEK – 2401 (C.B.S Scientific - Mỹ), đệm TAE 1x, nhiệt độ 60oC, hiệu điện 100V, thời gian 16 (Jun Wang et al., 2008) Sau điện di, gel nhuộm dung dịch HydraGreen Safe DNA Stain 1x 30 phút, sau rửa lại nước cất 10 phút quan sát máy soi gel LMW-20 UVP (UK) Để có “mã vạch” đối chứng cho loại vi khuẩn gel DGGE, sử dụng chủng chuẩn mua Viện bảo tàng vi sinh vật giống chuẩn Việt Nam Sản phẩm 16S rDNA đơn chủng trộn lại với lượng tương đương để sử dụng dấu chuẩn gel điện di Phân lập nuôi cấy vi khuẩn Các vi khuẩn mẫu chế phẩm phân lập ni cấy theo quy trình bản: Cân 0,1 g mẫu, dùng micropipette hút 900 µl nước muối sinh lý khử trùng, lắc máy vortex để nồng độ 10-1 Hút 100 µl mẫu nồng độ 10-1 vào ống chứa 900 µl nước muối sinh lý để nồng độ 10-2 , làm tương tự đến nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 Các sản phẩm men vi sinh cân pha loãng nước muối sinh lí vơ trùng tới nồng độ xác định để có từ 25 đến 250 khuẩn lạc mọc đĩa thạch A cấy trải 100 µl dịch tế bào mơi trường ni cấy thích hợp với loại vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng et al.,) Chúng sử dụng môi trường giàu dinh dưỡng LB phù hợp với hầu hết vi khuẩn nhằm thu số chủng vi sinh vật nhiều Ngoài môi trường MRS sử dụng để phân lập mẫu có chứa Lactobacillus Các đĩa ni hiếu khí 37oC, 18-24 Việc xác nhận chủng vi khuẩn phân lập dựa vào thông tin nhãn sản phẩm gốc việc quan sát hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc kiểu bắt màu thuốc nhuộm Gram KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách DNA tổng số mẫu men vi sinh Chúng tiến hành tách chiết DNA genome quần xã vi sinh vật 15 mẫu sản phẩm men vi sinh thu thập thị trường Qua kiểm tra, việc tách chiết DNA genome thành công với 10/15 mẫu (liệt kê Bảng 1) Việc tách DNA không thành công với mẫu cịn lại mẫu chứa nhiều tạp chất, phụ gia vitamin, chất tạo màu, tạo vị… gây khó khăn việc ly tâm, rửa mẫu mẫu bị vón cục, gây khó khăn q trình phân tách cột, chí khơng chứa vi sinh vật cơng bố Kết nhân gen đoạn 16S rDNA với 10 mẫu tách chiết cho băng có kích thước khoảng 1500 bp (Hình 1), chứng tỏ đoạn gen quan tâm khuếch đại thành cơng B Hình Điện di đồ phân tích sản phẩm khuếch đại 16S rDNA (kích thước 1500 bp) của: (A) mẫu men vi sinh khảo sát (ký hiệu mẫu trình bày Bảng 1); (B) 06 chủng chuẩn: Bacillus clausii (BC), Bacillus subtilis (BS), Bifidobacterium (Bi), Lactobacillus acidophilus (LA), Lactobacillus plantarum (LP), Streptococcus faecalis (ST), DNA chuẩn Kb DNA Ladder (L), Đối chứng âm (-) Kết phân tích quần xã vi sinh vật phương pháp DGGE Để chuẩn bị cho bước cuối điện di biến tính gel polyacrylamide, chúng tơi tiến hành khuếch đại vùng V3-V5 đoạn 16S rDNA với kích thước 550 bp thu kết thể Hình Kết điện di sản phẩm PCR thu 10 băng đậm khoảng 550 bp tương ứng với kích thước đoạn V3-V5 16S rDNA (Lopez et al., 2003) Điều cho thấy việc nhân gen vùng biến đổi V3-V5 16S rDNA 10 mẫu men vi sinh chủng chuẩn thành công, mồi sử dụng đặc hiệu Các băng có kích thước giống nhau, khác trình tự Kết điện di DGGE (Hình 3) thể thành phần quần xã vi khuẩn mẫu men 579 Trần Mỹ Hạnh et al vi sinh Trong kết này, băng đại diện cho lồi có mặt quần xã, đó, số lượng băng xuất mẫu tương ứng với số thành phần lồi vi sinh vật mẫu độ đậm nhạt băng phản ánh mật độ lồi Mẫu P22 P26 khơng lên băng DNA chất lượng (bị phân hủy) nên băng chưa phân tách gel điện di biến tính, chưa thể đánh giá xác thành phần vi sinh vật có mẫu Đảm bảo chất lượng nồng độ DNA sản phẩm PCR tối ưu hóa điều kiện cho phương pháp DGGE giải pháp cho mẫu dạng Bảng Các sản phẩm men vi sinh sử dụng điện di biến tính DGGE thành phần vi sinh vật cơng bố STT Kí hiệu mẫu Thành phần vi sinh vật nhãn mác Lactobacillus acidophilus P3 Bacillus subtilis Streptococcus faecalis P4 Lactobacillus acidophilus P7 Lactobacillus acidophilus P10 Bacillus Clausii P11 P14 Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Lactobacillus kefir P22 P26 Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Bacillus indicus P28 Bacillus clause Bacillus subtilis 10 P31 A Lactobacillus plantarum Bacillus B Hình Điện di đồ phân tích sản phẩm PCR vùng V3-V5 16S rDNA (kích thước 550 bp) (A) mẫu men vi sinh khảo sát (kí hiệu mẫu trình bày Bảng 1); (B) 06 chủng chuẩn: Bacillus clausii (BC), Bacillus subtilis (BS), Bifidobacterium (Bi), Lactobacillus acidophilus (LA), Lactobacillus plantarum (LP), Streptococcus faecalis (ST), Kb DNA Ladder (L), Đối chứng âm (-) 580 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 Hình Kết điện di DGGE phân tích thành phần vi sinh vật mẫu men vi sinh Các băng xuất giếng điện di DGGE thể (các) lồi vi khuẩn có mặt sản phẩm probiotics tương ứng giếng P11, P14, P28, P3, P4, P7, P10, P22, P26, P31: Các mẫu men vi sinh tiến hành khảo sát; BC (Bacillus clausii), BS (Bacillus subtilis), Bi (Bifidobacterium), LA (Lactobacillus acidophilus), LP (Lactobacillus plantarum), ST (Streptococcus faecalis): Các đơn chủng chuẩn làm đối chứng; M: Marker gồm băng tương ứng với chủng chuẩn; (-): Đối chứng âm Phân tích kết xác định thành phần vi sinh vật phương pháp DGGE so sánh với kết phân tích phương pháp nuôi cấy truyền thống Theo thống kê Bảng 2, kết đánh giá thành phần men vi sinh phương pháp DGGE cho thấy 3/10 (P10; P28; P31) sản phẩm tách DNA có thành phần vi sinh vật giống hồn tồn với cơng bố, 4/10 (P3; P4; P11; P14) thiếu 01 loài so với công bố, 1/10 (P7) sản phẩm không giống với công bố 2/10 (P22; P26) sản phẩm chưa xác định thành phần loài Bảng Kết so sánh phân tích thành phần vi sinh vật phương pháp phân lập truyền thống phương pháp phân tử DGGE STT Kí hiệu mẫu P3 P4 P7 P10 P11 P14 P22 P26 P28 10 P31 Thành phần vi sinh vật công bố Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophilus La5 Bifidobacterium Bb12 Streptococcus thermophiles TH4 Lactobacillus acidophilus Bacillus clausii Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Lactobacillus kefir Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis Bacillus clausii Bacillus subtilis Bacillus indicus Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae Số loài vi sinh vật phân lập Thành phần vi sinh vật thể gel DGGE chủng Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis chủng chủng chủng chủng Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium Bb12 Lactobacillus plantarum Streptococcus Bacillus clausii Streptococus Bacillus subtilis chủng Streptococus Bacillus subtilis chủng Không xác định chủng Không xác định chủng Bacillus clausii Bacillus subtilis chủng Lactobacillus plantarum Bacillus subtilis 581 Trần Mỹ Hạnh et al Để có thêm đánh giá việc áp dụng kỹ thuật DGGE việc kiểm định chất lượng sản phẩm men vi sinh, tiến hành thêm phương pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật theo cách truyền thống môi trường LB 0,5% môi trường MRS 15 mẫu men vi sinh khảo sát để so sánh đối chứng với kết phương pháp DGGE (Bảng 3, Hình 4) Xét số lượng lồi mẫu men vi sinh có từ việc phân lập phương pháp ni cấy, có 5/10 sản phẩm có đủ số lượng lồi cơng bố, việc phân biệt hay định danh xác loài vi khuẩn thành phần men vi sinh khẳng định trực quan Thêm nữa, số sản phẩm có chứa vi khuẩn Bifidobacterium gặp khó khăn việc ni cấy Bảng Kết phân lập dựa nuôi cấy 10 sản phẩm men vi sinh tách DNA để điện di DGGE STT Kí Thành phần vi sinh vật hiệu cơng bố mẫu P3 - Lactobacillus acidophilus - Bacillus subtilis - Streptococcus faecalis P4 - Lactobacillus acidophilus La5 - Bifidobacterium Bb12 - Streptococcus thermophiles P7 - Lactobacillus acidophilus 582 Các loại khuẩn lạc phân lập môi trường LB Các loại khuẩn lạc phân lập mơi trường MRS Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 P10 - Bacillus clausii P11 - Lactobacillus acidophilus P14 - Bacillus subtilis - Lactobacillus kefir P22 - Lactobacillus acidophilus - Bacillus subtilis - Lactobacillus acidophilus - Bifidobacterium 583 Trần Mỹ Hạnh et al 10 P26 - Lactobacillus acidophilus - Bacillus subtilis - Bacillus clausii - Bacillus subtilis P28 - Bacillus indicus P31 - Bacillus subtilis - Saccharomyces cerevisiae Các sản phẩm không tách DNA (5/15 sản phẩm) chọn để tiến hành nghiên cứu kiểm tra lại phương pháp phân lập vi sinh vật Kết (Hình 4) cho thấy mẫu mọc khơng có khuẩn lạc, nồng độ pha lỗng 10-1 Điều sở giải thích cho việc 584 không tách DNA tổng số phục vụ phân tích DGGE Đối với mẫu chứa vi khuẩn với nhãn sản phẩm, kết phân tích thành phần lồi DGGE tương tự với kết thu phân lập môi trường thích hợp Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 Như vậy, so sánh kết hai phương pháp thấy mối tương quan chặt chẽ kết phân tích DGGE với cơng bố nhãn với kết phân lập phương pháp nuôi cấy truyền thống Tuy nhiên rõ ràng kết từ phương pháp DGGE cung cấp nhiều thơng tin (chính xác đến tên lồi) có độ tin cậy hẳn so với phương pháp truyền thống Hiện nay, phương pháp nuôi cấy truyền thống sở tiêu chuẩn Việt Nam chế phẩm vi sinh (ví dụ TCVN 4884 : 2001 hướng dẫn chung định lượng vi sinh vật số tiêu chuẩn khác phát loại vi sinh vật đơn lẻ - thực tế chưa có tiêu chuẩn cụ thể cho men vi sinh); kết nghiên cứu có ý nghĩa tham khảo để hoàn thiện phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh Hình Hình ảnh đĩa phân lập 05 mẫu men vi sinh không tách DNA A, B, C, D, E mẫu P5, P6, -1 P9, P16, P18 pha lỗng nồng độ 10 ni cấy môi trường LB 0,5% Mặc dù kết nghiên cứu thể tiềm ứng dụng phương pháp DGGE, để khẳng định chắn kết so sánh hai phương pháp nêu trên, có lẽ cần thực thêm số thí nghiệm bổ trợ Ví dụ, cần tiến hành tách DNA đơn chủng phân lập từ mẫu men vi sinh, PCR nhân đoạn gen vùng V3-V5 16S rDNA phân tích DGGE để so sánh cụ thể đánh giá xác thành phần vi sinh vật, sở để khẳng định kết luận đưa từ phương pháp DGGE Về mặt hạn chế, phương pháp DGGE cung cấp thông tin định danh lồi mà khơng giúp phân biệt tế bào vi khuẩn sống hay chết thành phần men vi sinh (Patrone et al., 2016) Trong nghiên cứu gần đây, có hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh, phổ biến Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP (Rasmussen et al., 2012) hay Randomly Amplified Polymorphism DNA – RAPD (Dunbar et al., 2000) Mỗi phương pháp phân loại phân tử nói có hiệu khác 585 Trần Mỹ Hạnh et al với mục đích đối tượng nghiên cứu Tuy nhiên, để phân biệt loài khác dựa biomarker phổ biến áp dụng cho nhiều lồi, phương pháp thích hợp phương pháp DGGE phân tích trình tự gen 16S rRNA Phương pháp khơng q phức tạp tính tốn chọn lọc mồi hay enzyme giới hạn, việc phát triển ứng dụng phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm probiotic Việt Nam chưa nghiên cứu sâu đầy đủ Vì sở điều kiện phịng thí nghiệm kết nghiên cứu thấy tiềm kỹ thuật DGGE đánh giá chất lượng men vi sinh Có thể thấy hạn chế khác phương pháp phân tích dựa DGGE khơng đánh giá số lượng loại vi sinh vật chế phẩm Vì vậy, yêu cầu đặt ra, cần có bổ trợ phương pháp khác (như phương pháp truyền thống dựa ni cấy) Tuy nhiên, với tình hình mà chế phẩm vi sinh không đảm bảo chất lượng (nhiều số khơng đảm bảo thành phần vi sinh vật kết nghiên cứu cho thấy) mạnh ứng dụng phương pháp dựa DGGE phát nhanh chế phẩm khơng đạt u cầu thành phần lồi KẾT LUẬN Từ kết tổng hợp nêu trên, nhận định sơ phần lớn chế phẩm probiotic thị trường không đảm bảo chất lượng công bố, đặc biệt thành phần lồi Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực phân tích với 10 mẫu ngẫu nhiên tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu (khẳng định phương pháp DGGE nuôi cấy truyền thống) 30% Trong nghiên cứu xa hơn, việc phân tích với số lượng mẫu lớn thu tỷ lệ phản ánh xác thực trạng Với thực trạng trên, nói nhu cầu phân tích xác thành phần chế phẩm để giúp xác định chế phẩm đảm bảo chất lượng quan trọng Phương pháp phân tích truyền thống, phương pháp thường quy, thường đòi hỏi nhiều thời gian khơng đảm bảo định danh xác hồn tồn vi sinh vật chế phẩm Vì vậy, kết nghiên cứu kiểm chứng khả đánh giá chất lượng chế phẩm probiotic phương pháp DGGE cho thấy phương pháp tỏ hiệu có tính xác cao Nói cách khác, để xác định thành phần vi sinh vật sản phẩm men vi sinh với quy trình xác tiện lợi phương pháp 586 phân tích bẳng kỹ thuật điện di gradient nồng độ chất biến tính (DGGE) thích hợp tiềm Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện hỗ trợ kinh phí cho nhóm nghiên cứu thực đề tài (MS: TN17.09) Để hoàn thành đề tài, nhóm nghiên cứu nhận hỗ trợ, giúp đỡ từ thầy cô, đồng nghiệp Khoa Sinh học Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN TÀI LIỆU THAM KHẢO Cho SS, Finnocchiaro ET (2010) Handbook of Prebiotic and Probiotic Ingredient: health benefits and food application CRC Press, London: 163-208 Deng B, Shen CH, Shan XH, Ao ZH, Zhao JS, Shen XJ, Huang ZG (2012) PCR-DGGE analysis on microbial communities in pit mud of cellars used for different periods of time J Inst Brew 118: 120–126 Dunbar J, Lawrence OT, Cheryl RK (2000) Assessment of microbial diversity in four southwestern United States soils by 16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis Appl Environ Microbiol 66(7): 2943-2950 Hanna S, Fordymacka A, Bardowski J, Gorecki RK, Mrukowicz JZ and Banaszkiewicz A (2004) Microbiological and genetic analysis of probiotic products licensed for medicinal purposes Med Sci Monit 10: 346350 Hasler CM (2002) Functional foods: benefits, concerns and challenges – a position paper from the American Council on Science and Health Kołozyn- Krajewskaa D, Dolatowski ZJ (2012) Probiotic meat products and human nutrition Process Biochem 47: 1761–1772 Levin W (2011) Probiotics- The road map Int J Probiotics Prebiotics 6: 133-140 Lopez I, Ruiz-Larrea F, Cocolin L, Orr E, Phister T, Marshall M, VanderGheynst J, Mills DA (2003) Design and evaluation of PCR primers for analysis of bacterial populations in wine by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Appl Environ Microbiol 69(11): 68016807 Marimuthu A, Rizwana PR, Manas RS (2017) Production of High- Quality Probiotics by Fermentation InVijai KG, Helen T, Volha OS, Luiz AO, Maria GT Microbial Functional Foods and Nutraceuticals John Wiley & Son, NJ: 235-266 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 577-588, 2019 Muyzer G (1999) DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems Curr Opin Microbiol 2(3): 317-322 Muyzer G, Uitterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA Appl Environ Microbiol 59(3): 695-700 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Khái quát phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống Giáo trình vi sinh vật học VOER Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Thu Hường, Trịnh Thị Thùy Linh, Nhữ Thị Hà, Trịnh Thị Hảo, Nguyễn Thành Linh, Đặng Xuân Nghiêm (2014) Khảo sát thành phần vi sinh đặc tính probiotic sản phẩm men tiêu hóa thị trường Tạp chí Khoa học Phát triển 12(1): 65-72 Rasmussen HB (2012) Restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified fragments (PCRRFLP) and gel electrophoresis-valuable tool for genotyping and genetic fingerprinting In Sameh M Gel Electrophoresis - Principles and Basics InTech, Croatia: 315-334 Ravi NS, Pravin DS, Khedkar CD, Ajay S (2014) Selection criteria for probiotics: a review Int J Probiotics Prebiotics 9(1):17-22 Saxelin M, Tynkkynen S, Salusjärvi T, Kajander K, Myllyluoma E, Mattila-Sandholm T, Korpela R (2010) Developing a multispecies probiotic combination Int J Probiotics Prebiotics 5: 169-182 Shah NP (2000) Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods J Dairy Sci 83(4): 894-907 Urashima Y, Sonoda T, Fujita Y, Uragami A (2012) Application of PCR-Denaturing-Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Method to Examine Microbial Community Structure in Asparagus Fields with Growth Inhibition due to Continuous Cropping Microbes Environ 27(1): 43–48 Valášková V, Baldrian P (2009) Denaturing gradient gel electrophoresis as a fingerprinting method for the analysis of soil microbial communities Plant Soil Environ 55(10): 413–423 Wang J, Ma T, Zhao LX, Lv JH, Li GQ, Liang FL, Liu RL (2008) PCR–DGGE method for analyzing the bacterial community in a high temperature petroleum reservoir World J Microbiol Biotechnol 24:1981–1987 Yeung PS, Sanders ME, Kitts CL, Cano R, Tong PS (2002) Species-Specific Identification of Commercial Probiotic Strains J Dairy Sci 85(5): 1039-1051 Yaeshima T, Takahashi S, Ishibashi N, and Shimamura S (1996) Identification of bifidobacteria from dairy products and evaluation of microplate hybridization method Int J Food Microbiol 30: 303–313 EVALUATING THE QUALITIES OF PROBIOTIC PRODUCTS BY A DGGE-BASED PROCEDURE Tran My Hanh, Cao Thi Dung, Tran Thi Thanh Huyen, Pham The Hai University of Science, Vietnam National Universit, Hanoi SUMMARY The quality of the probiotics is determined by the microbiological composition and can thus be verified by analyzing this characteristic The use of the Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) allows the detection of each microorganism through the corresponding band on the gel, which can be considered as the "bar code" of that microorganism This "bar code” principle demonstrates the potential for the application of DGGE technology to test microbial probiotics with or without a bacterium as registered to assess whether they are qualified As such, in this study, we experiment the application of DGGE method to test 10 commercial probiotic products, with a focus on products consisting of only bacteria which dominate the market First, we performed DNA genome extraction and amplification of 550 bp DNA of the 16S rDNA by PCR Then, the amplicon was analysed on polyacrylamide gels containing a 30% to 60% linear denaturing gradient of urea and formamide Microbial composition of of the 10 products showed a strong correlation between DGGE results with product 587 Trần Mỹ Hạnh et al labeling as well as isolation of micoorganism This study thus demonstrates the potential application of DGGE technology in evaluating the qualities of probiotic products Keywords: 16S rDNA, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), probiotic, isolation of microorganisms, DNA extraction 588 ... cao vi? ??c sử dụng phương pháp truyền thống Chính từ nhu cầu thực tiễn vi? ??c kiểm soát chất lượng chế phẩm men vi sinh tính hiệu phương pháp điện di gel gradient biến tính, chúng tơi tiến hành nghiên. .. tồn vi sinh vật chế phẩm Vì vậy, kết nghiên cứu kiểm chứng khả đánh giá chất lượng chế phẩm probiotic phương pháp DGGE cho thấy phương pháp tỏ hiệu có tính xác cao Nói cách khác, để xác định thành. .. tiến hành nghiên cứu với mục đích tìm hiểu khả ứng dụng phương pháp DGGE vi? ??c đánh giá chế phẩm vi sinh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Các mẫu men vi sinh (chứa vi khuẩn, 15 mẫu)