Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở miền bắc việt nam dựa trên chỉ thị matk

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  ĐỖ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (Hedera nepalensis K Koch) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ matK KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: ĐỖ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (Hedera nepalensis K Koch) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ matK KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) : QH2015.Y Khóa Người hướng dẫn : ThS Phạm Thị Hồng Nhung Lời cảm ơn Để hồn thành khóa luận, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý bạn Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất lẫn tinh thần, kinh nghiệm kiến thức chuyên môn thầy cơ, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn ThS Đỗ Thị Lệ Hằng bạn Bùi Thị Yến hỗ trợ giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm Các cô, bạn không trang bị cho tơi kiến thức, mà cịn truyền cho tơi niềm đam mê, lịng nhiệt huyết, kiên trì ln sẵn sàng giúp đỡ tơi gặp khó khăn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ mơn Y Dược học sở hết lịng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn cán Viện Dược liệu - Bộ Y tế khơng quản ngại khó khăn thu thập cung cấp mẫu vật giúp đỡ thực đề tài cách thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập nhà trường Chúng tơi trân trọng cảm ơn tài trợ kinh phí Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn u thương đến gia đình bạn bè ln bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Tác giả Đỗ Hạnh Nguyên DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ (base pair) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) dNTP Deoxyribonucleotide 5’ triphosphate GBSSI Gen mã hóa enzyme tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch Synthase) Genbank Ngân hàng liệu gen quốc tế H.helix Thường xuân (Hedera helix L.) H.nepalensis Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ITS Vùng chép nội (Internal transcribed spacer) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) matK Maturase K ML Maximum Likelihood NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) OD Mật độ quang học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) RNA Axit ribonucleic (Ribonucleic acid) TrnK Translocated tRNA-Lys gene UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số cặp mồi sử nghiên cứu phân loại Bảng 1.2 Các tác dụng dược lý H nepalensis 20 Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số mẫu nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Các thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen matK 30 Bảng 3.3 Các trình tự tham chiếu lấy từ Genbank sử dụng nghiên cứu 31 Bảng 3.4 Phân nhóm mẫu nghiên cứu 32 Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía tên bên phải) 03 haplotype với 03 trình tự tham chiếu 32 Bảng 4.1 Trình tự mồi gen matK sử dụng nghiên cứu chi Hedera giới 43 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Vị trí gen matK 11 Hình 1.2 Đặc điểm hình thái Dây thường xuân 17 Hình 1.3 Phân bố địa lý Dây thường xuân miền Bắc Việt Nam 18 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 1,2% 26 Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dịng gen matK 28 Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen matK 29 Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen matK 29 Hình 3.5 Kết PCR nhân dịng đoạn gen matK 30 Hình 3.6 Kết hiển thị giải trình tự mẫu đại diện H4 gen matK qua phần mềm BioEdit 31 Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen matK haplotype nghiên cứu với trình tự tham chiếu 33 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp UPGMA 03 haplotype nghiên cứu với 03 trình tự tham chiếu dựa thị matK 34 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp Maximum Likelihood 03 haplotype nghiên cứu với 03 trình tự tham chiếu dựa thị matK 35 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp UPGMA 03 haplotype nghiên cứu với trình tự loài Hedera dựa thị matK 36 MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đa dạng phân loại sinh học 1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học 1.1.2 Đa dạng di truyền 1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học Việt Nam 1.1.4 Các phương pháp phân loại học 1.2 Cơng cụ phân tích đa dạng di truyền tiến hóa 1.2.1 Tổng quan mã vạch DNA 1.2.2 Ứng dụng mã vạch DNA thực vật 1.2.3 Vùng gen lục lạp matK (maturase K) 11 1.3 Phân tích phát sinh gen (Phylogenetic Analysis) 12 1.3.1 Lựa chọn trình tự sinh học 12 1.3.2 Sắp xếp đa chuỗi 13 1.3.3 Lựa chọn mơ hình tiến hóa 13 1.3.4 Xây dựng phát sinh loài 14 1.3.5 Đánh giá phát sinh loài 15 1.4 Tổng quan loài Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 15 1.4.1 Đặc điểm hình thái chung loài Dây thường xuân 15 1.4.2 Đặc điểm phân bố, sinh thái 18 1.4.3 Thành phần hóa học 19 1.4.4 Tác dụng dược lý 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng 21 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 21 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 22 2.3 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 22 2.3.1 Hóa chất 22 2.3.2 Trang thiết bị 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 24 2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích kỹ thuật PCR 24 2.4.3 Tinh giải trình tự 25 2.4.4 Xử lý số liệu phân tích kết 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Tách chiết DNA tổng số 26 3.2 Kết tối ưu hóa quy trình nhân dịng đoạn gen matK kỹ thuật PCR 27 3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 27 3.2.2 Kết nhân dòng gen matK từ mẫu thực vật 29 3.3 Giải trình tự 31 3.4 Độ tương đồng trình tự gen matK khuếch đại 31 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa vùng gen matK 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 38 4.1 Kết xây dựng quy trình phân tích đoạn gen matK 38 4.1.1 Tách chiết DNA tổng số 38 4.1.2 Khuếch đại đoạn gen matK 39 4.1.3 Giải trình tự so sánh độ tương đồng 40 4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân sử dụng mã vạch matK .40 4.2.1 Khoảng cách di truyền 40 4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân miền Bắc Việt Nam 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên có hệ thực vật phong phú đa dạng, đặc biệt phải kể đến nhóm tài nguyên thuốc Theo kết điều tra Viện Dược liệu, Việt Nam có 3948 lồi thực vật bậc cao, bậc thấp nấm lớn dùng làm thuốc [2] Tuy nhiên, phần lớn thuốc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian theo Y học cổ truyền mà chưa nghiên cứu cách chuyên sâu đầy đủ Vì vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứu đánh giá xác mức độ đa dạng di truyền loài thuốc nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo nhân giống để đáp ứng yêu cầu phát triển công nghiệp chế biến dược liệu bền vững Trong hệ thực vật đó, Hedera (L.) chi thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) giới ghi nhận 16 loài, số lồi biết có giá trị làm thuốc [15] Trong số đó, lồi đến sử dụng rộng rãi nghiên cứu nhiều dược học Thường xuân - H helix Dây thường xuân - H nepalensis có phạm vi phân bố tương đối hẹp giới Theo H helix tìm thấy chủ yếu Châu Âu phần Nam Á, H nepalensis phát phân bố nước châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Nepal, Thái Lan,… Ở Việt Nam, loài báo cáo xuất số tỉnh vùng núi phía Bắc Lào Cai, Hà Giang, H helix nhà khoa học giới chứng minh có nhiều tác dụng dược lý điều trị bệnh hô hấp, nhiễm khuẩn, bảo vệ gan phát triển thành thuốc điều trị viêm đường hơ hấp cấp mạn tính (Prospan) Trong Việt Nam, Dây thường xuân (H nepalensis) chủ yếu dùng làm cảnh chưa có nghiên cứu thành phần hố học tác dụng dược lý Trong Dây thường xuân có chứa hợp chất n-hexan ethyl acetate có tác dụng chống ung thư [55], ngồi cịn chứa lupeol, triterpenoid có hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 với tiềm chữa bệnh tiểu đường [40, 83] Không vậy, nhiều nghiên cứu chứng minh H nepalensis có tác dụng bảo vệ thần kinh [40], chống viêm, giảm đau, chống đông máu chống trầm cảm [52] Với tiềm dược lý vậy, song chưa có nhiều nghiên cứu H nepalensis, đặc biệt nghiên cứu đánh giá tiềm đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen Chúng cho việc phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân thực cần thiết phạm vi phân bố tự nhiên loài giới tương đối hạn chế Ngoài yêu cầu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xn Việt Nam, định loại xác lồi để từ có chiến lược bảo tồn, khai thác phát triển vấn đề nghiên cứu cấp thiết Trên giới, việc sử dụng thị DNA ngày dùng rộng rãi nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền đặc trưng cá thể quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn chọn giống So với thị truyền thống (chỉ thị hình thái thị hóa học), thị DNA mang ưu điểm bật: dễ thực điều kiện phịng thí nghiệm, khơng phụ thuộc vào yếu tố môi trường tượng tương tác gen, xác định biến dị DNA giai đoạn khác quan khác thực vật Để phục vụ cho nghiên cứu này, sử dụng thị phân tử matK (maturase K) vùng gen lục lạp làm công cụ giúp xây dựng phát sinh loài Mã vạch thị phân tử bật ứng dụng thành công nhiều nghiên cứu giúp phân tích đa dạng di truyền định danh nhiều lồi thực vật, kể đến chi Panax, chi Alium[14], họ Valerianaceae [46] hay chi Dalbergia [22],… Nhưng câu hỏi đặt liệu matK có phải thị DNA thích hợp để phân tích đa dạng di truyền lồi Dây thường xn hay khơng? Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch) miền Bắc Việt Nam dựa thị matK” Nghiên cứu hướng đến hai mục tiêu: Xây dựng quy trình nhân dòng đoạn gen matK Dây thường xuân Xây dựng phát sinh chủng loại dựa vào thị matK dùng thị để đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân thu thập miền Bắc Việt Nam Để thực mục tiêu nghiên cứu này, tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Tách DNA tổng số thu từ mẫu khô Dây thường xuân Tối ưu phản ứng PCR tiến hành nhân dòng đoạn gen matK Giải trình tự vùng gen matK nhân dòng Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị matK 4.1.2 Khuếch đại đoạn gen matK Tối ưu phản ứng PCR bước cần làm để đạt hiệu suất nhân dịng gen cao Khơng vậy, tối ưu quy trình giúp chuẩn hố điều kiện phản ứng tiết kiệm thời gian q trình thí nghiệm yếu tố liên quan đến phản ứng tối ưu là: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA khuôn nồng độ mồi Với gen matK, Cuénoud cộng chọn 48 ºC làm nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 390F/1326R phân tích mẫu thuộc Caryophyllales [29] Nhiệt độ gắn mồi khác nghiên cứu so với nghiên cứu khác DNA polymerase, chí ảnh hưởng hệ thiết bị khác Chính vậy, tối ưu nhiệt độ gắn mồi cần thực để có quy trình PCR ổn định Nhiệt độ gắn mồi yếu tố quan trọng giúp cho mồi bắt cặp thành công với DNA yếu tố định phản ứng PCR có thực hay khơng Đối với mẫu thực vật, nồng độ DNA khuôn cao thường ức chế phản ứng nhân dòng tồn tạp chất cịn tồn lưu DNA khn Qua q trình thực nghiệm, chúng tơi nhận thấy kết nhân dòng gen matK đạt hiệu suất cao Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy băng DNA lên rõ nét, kích thước mẫu đồng đều, khơng có băng phụ chứng tỏ phản ứng nhân dịng đặc hiệu Có thể thấy, việc nhân mã vạch matK chi Hedera khơng gặp nhiều khó khăn, tỷ lệ khuếch đại thành cơng 100% Ngun nhân mức độ đa hình đoạn trình tự lồi khơng cao, khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu Điều dẫn đến tỷ lệ vị trí mang thơng tin khơng đáng kể Ngồi ra, q trình thực nghiệm có số mẫu cần PCR nhiều lần (2-3 lần) mẫu DNA tổng số có số chất chuyển hóa ảnh hưởng đến q trình PCR kỹ thuật Cặp mồi 390F/1326R sử dụng nghiên cứu ứng dụng nhiều nghiên cứu trước khuyến cáo làm mã vạch phân loại thực vật Trong nghiên cứu Lei cộng (2014) 27 lồi thực vật có độc thuộc 22 chi 17 họ Trung Quốc, cặp mồi đánh giá hiệu cao định danh loài [68] Ngoài ra, Sun cộng nhân lên đoạn gen matK dài 907 bp giúp phân biệt Helleborus với chi khác [90] Năm 2002, Cuénoud sử dụng cặp mồi 390F/1326R khuếch đại khoảng 930 bp trình tự matK giúp phân loại Caryophyllales [29] Độ dài đoạn gen matK nhân lên cặp mồi 390F/1326R nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu 39 4.1.3 Giải trình tự so sánh độ tương đồng 43/43 mẫu giải trình tự thành cơng đoạn gen matK Tuy nhiên, kết giải trình tự số mẫu bị nhiễu cần thực lại phản ứng PCR Đa số sản phẩm PCR giải trình tự theo chiều mồi xi (390F), nhiên có số mẫu đọc giải trình tự theo mồi ngược (1326R) kết trình tự đọc theo chiều 390F bị nhiễu Điều giải thích gen matK có độ dài tương đối lớn, số đoạn trình tự có độ biến thiên cao, q trình bắt cặp gắn thêm base nitơ gây nhầm lẫn Về độ tương đồng mẫu nghiên cứu đối chiếu với trình tự Genbank nhằm tìm lồi tương đồng, đồng thời đảm bảo đoạn gen nhân lên vùng trình tự quan tâm Trong đó, haplotype N1 có trình tự tương đồng 100% với trình tự GQ434260.1 H nepalensis var sinensis Haplotype N2 có trình tự tương đồng 99,88% với trình tự GQ434260.1 H nepalensis var sinensis Haplotype N3 có trình tự tương đồng 100% với trình tự AJ319073.1 H helix, trình tự mẫu H3, H48, H52 thu thập Việt Nam giống 100% với trình tự HH đối chứng từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc Các trình tự khuếch đại cặp mồi 390F/1326R có độ dài khoảng 920 bp thuộc vùng gen matK Kết giải trình tự sau so sánh độ tương đồng chương trình BLAST đủ điều kiện làm liệu phục vụ cho xây dựng phát sinh lồi nhằm phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân miền Bắc Việt Nam 4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân sử dụng mã vạch matK 4.2.1 Khoảng cách di truyền Bảng khoảng cách di truyền thể vị trí sai khác mối quan hệ tiến hóa trình tự đoạn gen matK haplotype với nhóm nội H nepalensis GQ434260.1, H helix AJ319073.1 nhóm ngoại T papyrifer GQ434267.1 Kết cho thấy nhóm N1 khơng có vị trí sai khác với H nepalensis đối chứng, nhóm N2 có 01 vị trí sai khác với H nepalensis đối chứng Nhóm N3 khơng có vị trí sai khác với H helix đối chứng Theo Hình 3.7, nhóm N1 sai khác với nhóm N3 vị trí (T>G vị trí 606 G>A vị trí 782) Nhóm N2 sai khác với nhóm N1 vị trí (G>A vị trí 782) Nhóm N2 sai khác với nhóm N3 vị trí (T>G vị trí 606) Trong đó, đột biến thay vị trí 606 dị hốn (từ pyrimidine sang purine) vị trí 782 đồng hoán (từ purine sang purine) Trong thực tế, đột biến thay base có xu hướng nghiêng đột biến đồng hoán, số đột 40 biến thay base tự phát tỷ lệ đột biến đồng hốn : dị hốn Vì vậy, đột biến dị hốn có trọng số cao (có ý nghĩa hơn) nghiên cứu phát sinh loài Các đột biến hình thành haplotype chi Hedera Việt Nam Độ dài đoạn gen matK sử dụng để so sánh BLAST chạy ClustalW 792, số nucleotide bảo thủ lên đến 790 (tỷ lệ đột biến 0,25%) Tuy nhiên, từ bảng khoảng cách di truyền phát sinh chủng loại, nhận thấy vị trí đa hình mang thơng tin hữu ích cho việc phân lồi Haplotype N2 tồn Lào Cai Lào Cai tỉnh xuất haplotype N2 N3 Từ nhận định Lào Cai địa phương có điều kiện mơi trường địa lý phù hợp cho Dây thường xuân (haplotype N2) Thường xuân (haplotype N3) sinh trưởng phát triển Ngoài ra, cịn kết luận thị matK giúp phân biệt haplotype N2 với haplotype khác góp phần định danh haplotype Lào Cai Haplotype N3 gồm mẫu H3, HH, H48, H52 có mẫu H3, H48, H52 thu thập Việt Nam thuộc loài H helix mẫu mẫu nhập trồng, khơng phải lồi địa hoang dại hóa theo điều tra Viện Dược liệu N3 xuất Sa Pa (Lào Cai) Đà Lạt (Lâm Đồng) Điều chứng tỏ địa phương có điều kiện khí hậu địa lý phù hợp cho sinh trưởng phát triển H helix Vì vậy, muốn trồng Thường xuân để bảo tồn giống làm nguyên liệu phục vụ cho sản xuất thuốc nên cân nhắc vùng Phân bố địa lý haplotype cho thấy N1 haplotype phổ biến với số lượng lớn (32/43 mẫu) xuất ba tỉnh miền núi phía Bắc Lai Châu, Hà Giang, Lạng Sơn Theo điều tra Viện Dược liệu từ kết nghiên cứu chúng tơi N1 thuộc lồi H nepalensis var.sinensis Haplotype N1 gồm mẫu sống môi trường tự nhiên Điều chứng minh rằng, nay, H nepalensis dễ sinh trưởng phát triển tỉnh miền núi phía Bắc 4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân miền Bắc Việt Nam Chúng chọn UPGMA Maximum Likelihood hai phương pháp để xây dựng phát sinh loài Nguyên lý phương pháp UPGMA xây dựng ma trận khoảng cách khơng có trọng số, so sánh điểm tương đồng trình tự Các trình tự ghép cặp với nhau, giống tương đồng Ưu điểm phương pháp cho kết nhanh, phù hợp để xử lý lượng lớn số liệu cho biết khoảng cách di truyền tương đối lồi Tuy nhiên, phương pháp UPGMA khơng phản ánh tiến hóa gen khơng phải đột biến có 41 trọng số Để khắc phục nhược điểm UPGMA, tiến hành phương pháp Maximum Likelihood Phương pháp sử dụng tất thơng tin tiến hóa gồm thay riêng lẻ chuỗi Đối với vị trí, tất đánh giá cho điểm dựa số lượng thay đổi tiến hóa cần thiết để tạo thay đổi trình tự quan sát ML tính tốn khả cho xác định tiến hóa có xác suất xảy cao Vì vậy, phát sinh chủng loại phương pháp cung cấp thơng tin xác chi tiết so với phương pháp khác Phương pháp thường dùng để kiểm chứng lại phân loài xây dựng từ phương pháp khác Nhưng nhược điểm tốc độ xử lý thơng tin chậm khơng khả thi phân tích lượng liệu lớn Với phân loài theo phương pháp UPGMA Maximum Likelihood, nhóm mẫu phân nhánh cho kết tương đồng thể tin cậy nhánh (có đồng thuận cây) Chỉ thị matK cho thấy phân biệt loài khác chi họ Araliaceae Cụ thể nghiên cứu này, sử dụng T papyrifer GQ434267.1 làm nhóm ngoại Kết cho thấy T papyrifer tách nhánh tốt, trở thành nhánh riêng biệt với lồi chi Hedera Kết góp phần chứng minh matK mã vạch phân tử tốt để phân biệt định danh loài khác chi, khác họ theo nhiều nghiên cứu trước Với nhóm nội, cụ thể, nhánh N3 (4 mẫu thuộc loài H helix H3, HH, H48 H52) cho giá trị bootstrap lớn 65% phân loài với mức độ ủng hộ cao; 32 mẫu thuộc nhóm N1 có quan hệ chặt chẽ với H nepalensis var.sinensis đạt mức độ tin trung bình Maximum Likelihood mẫu nhóm N2 có mối quan hệ gần gũi với N1 H nepalensis var.sinensis với mức độ tin cậy thấp hai Điều chứng tỏ khả tách nhánh N2 khỏi nhánh N1 H nepalensis var.sinensis thấp Theo phân loại hình thái mẫu N2 thuộc loài H nepalensis var.sinensis nhiên haplotype N2 khơng tương đồng 100% với trình tự H nepalensis tham chiếu Sự sai khác giải thích có biến đổi trình tự nucleotide thay đổi môi trường địa lý khí hậu Tuy số bootstrap khơng cao (52% UPGMA 28% Maximum Likelihood) chọn lại có khả xuất cao tất tạo thành Vì kết luận haplotype N2 thuộc loài H nepalensis Kết phân loài chủng loại giống với kết phân loại dựa đặc điểm hình thái (N1, N2: H nepalensis 42 H.nepalensis var.sinensis H.nepalensis var.nepalensis Theo hình thái, H.nepalensis var.nepalensis var.sinensis phân biệt dựa hai đặc điểm bao gồm số lượng thùy (5 var.nepalensis var.sinensis) số lượng thùy bên (nhiều var.nepalensis khơng có var.sinensis) Tuy nhiên, số mẫu H.nepalensis var.sinensis cho thấy thay đổi số lượng thùy (từ đến 5) Sự trùng lặp xảy H.nepalensis var.nepalensis var.sinensis đặc điểm sử dụng để phân biệt chúng không quán [16] Trong nghiên cứu chúng tơi, sử dụng mã vạch matK lồi Dây thường xuân thu thập miền Bắc Việt Nam loài H.nepalensis var.sinensis Vậy Dây thường xuân Việt Nam thuộc thứ lồi H.nepalensis var.sinensis hay trình tự đoạn gen matK chưa giúp phân biệt H.nepalensis var.nepalensis var.sinensis nghiên cứu trước Ackerfied Wen (năm 2003) [15] Liệu H.nepalensis H.sinensis hai lồi khác hay chúng có quan hệ gần gũi thuộc lồi? Hiện nay, trình tự tham chiếu Genbank chưa có thống tên gọi hai đối tượng Có số trình tự tên tiêu đề H.sinensis thông tin phân loại lại ghi H.nepalensis var.sinensis Điều chứng tỏ tính đến thời điểm cịn nhiều tranh cãi vị trí phân loại hai đối tượng Nghiên cứu chưa giải khác biệt di truyền thứ lồi khơng có đủ liệu trình tự H.nepalensis var.nepalensis (cả Genbank) Vì vậy, kiến nghị nên thu thập thêm mẫu H.nepalensis var.nepalensis để làm rõ tranh cãi mặt hình thái góp phần hồn thiện hệ thống phân loại thực vật chi Hedera Thực vật dùng làm thuốc cần xác định mức độ phân loại loài, bước quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy trình tự matK bảo thủ, có khả phân biệt định danh H.nepalensis với H.helix nên có ý nghĩa kiểm định dược liệu, tránh tình trạng dược liệu giả gây nguy hại đến sức khỏe người dùng Ngoài ra, nghiên cứu Việt Nam có lồi thuộc chi Hedera H.helix H.nepalensis Trong đó, H.nepalensis phân bố chủ yếu tỉnh miền núi phía Bắc cịn H.helix tìm thấy Lào Cai Lâm Đồng Theo điều tra Viện Dược liệu mẫu H helix giống nhập trồng, khơng phải lồi địa hoang dại hóa Kết sở phục vụ công tác bảo tồn phát triển nguồn gen Dây thường xuân chọn giống phân tích phát sinh vùng địa lý 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, chúng tơi rút số kết luận sau: Đã xây dựng quy trình nhân dòng đoạn gen matK Dây thường xuân Đoạn gen matK 43 mẫu Dây thường xuân khuếch đại giải trình tự thành cơng Đã xây dựng phát sinh chủng loại dựa vào thị matK Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa thị matK cho thấy thị có khả phân loại H nepalensis với H helix Qua nghiên cứu này, xác định Việt Nam tồn loài thuộc chi Hedera H nepalensis H.helix, H nepalensis phân bố chủ yếu tỉnh miền núi phía Bắc gồm: Lào Cai, Lạng Sơn, Lai Châu, Hà Giang H helix tìm thấy Sa Pa (Lào Cai) Đà Lạt (Lâm Đồng) Xác định haplotype với thị matK haplotype N1 phổ biến phân bố tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam Kiến nghị Hướng đến chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu Việt Nam, giúp đưa nguồn dược liệu chất lượng tốt tạo thành thành phẩm thuốc phục vụ cộng đồng phòng điều trị bệnh hiệu quả, chúng tơi có số kiến nghị sau: Tiếp tục thu thập thêm mẫu thuộc chi Hedera để đánh giá tồn diện tính đa dạng phân bố chi Việt Nam Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học để tìm hoạt chất có hoạt tính dược lý kết hợp với nghiên cứu đa dạng nguồn gen để lựa chọn giống có chất lượng tốt nhất, từ phát triển Dây thường xuân thành dược liệu có giá trị y học giá trị kinh tế cao 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tập 2, tr.1076 Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 739-743 Võ Văn Chi (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, Nhà xuất Giáo Dục Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 778-779 Nguyễn Anh Diệp, Trần Ninh Nguyễn Xuân Quýnh (2007), Nguyên tắc phân loại sinh vật, NXB Khoa học Kĩ thuật Nguyễn Hiếu (2017), "Đa dạng sinh học Việt Nam, thực trạng thách thức", 4-17 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất Trẻ, tr 551 Đinh Đoàn Long Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Đặng Ngọc Thanh Trần Đức Lương (2018), "Thực trạng xu hướng phát triển phân loại học sinh vật", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam,(2A),62 10 Nguyễn Đức Thành (2014), "Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật", Tạp chí Sinh học,36 (3), tr 265-294 11 Nguyễn Thị Thu Thảo (2019), Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) Việt Nam dựa thị GBSSI Khoa Y-Dược, ĐHQGHN 12 Viện Dược Liệu (2016), Danh lục thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 303 13 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật TIẾNG ANH 14 Abugalieva, S., et al (2017), "Taxonomic assessment of Allium species from Kazakhstan based on ITS and matK markers", BMC plant biology,17 (2),258 15 Ackerfield, J and J Wen (2003), "Evolution of Hedera (the ivy genus, Araliaceae): insights from chloroplast DNA data", International Journal of Plant Sciences,164 (4),593-602 16 Ackerfield, J and J Wen (2002), "A morphometric analysis of Hedera L.(the ivy genus, Araliaceae) and its taxonomic implications", Adansonia,24 (2),197-212 17 Adnan, M., et al (2012), "Medicinal plants and their uses in selected temperate zones of Pakistani Hindukush-Himalaya", J Med Plants Res,6 (24),4113-4127 18 Baharum, S.N (2012), "Application of 16s rDNA and cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage and fish populations structure of aquatic species", Molecular biology reports,39 (5),5225-5232 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Barratt, B., et al (2003), "Morphospecies as a substitute for Coleoptera species identification, and the value of experience in improving accuracy", Journal of the Royal Society of New Zealand,33 (2),583-590 Barthet, M.M and K.W Hilu (2007), "Expression of matK: functional and evolutionary implications", American Journal of Botany,94 (8),1402-1412 Bashir Amad, N.M., Shumaila Bashir, Sadiq Azam, Ibrar Khan, Mohammad Ayub (2012), "Biological screening of Hedera nepalensis", Medicinal Plants Research,6 (39),5250-5257 Bhagwat, R.M., et al (2015), "Two new potential barcodes to discriminate Dalbergia species", PloS one,10 (11),e0142965 Bhargava, M and A Sharma (2013), "DNA barcoding in plants: evolution and applications of in silico approaches and resources", Molecular phylogenetics evolution,67 (3),631-641 Bošeľová, D., et al (2016), "Comparative analysis of different methods of Hedera helix DNA extraction and molecular evidence of the functionality in PCR", Acta Fytotechnica et Zootechnica,19 (4),144-149 Brown B., Emberson R.M and Paterson A.M (1999), "Mitochondria COI and II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepia idae) species identification", Bulletin of Entomological Research,89 (4),287-294 Brown, W.M., M George and A.C Wilson (1979), "Rapid evolution of animal mitochondrial DNA", Proceedings of the National Academy of Sciences,76 (4),1967-1971 Chen, S., et al (2010), "Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species", PloS one,5 (1), Chiou, S.-J., et al (2007), "Authentication of medicinal herbs using PCRamplified ITS2 with specific primers", Planta medica,73 (13),1421-1426 Cuénoud, P., et al (2002), "Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences", American Journal of Botany,89 (1),132-144 Dabo, S., E Mitchell and U Melcher (1993), "A method for the isolation of nuclear DNA from cotton (Gossypium) leaves", Analytical biochemistry,210 (1),34-38 Dhivya Selvaraj, Rajeev Kumar Sarma and Ramalingam Sathishkumar (2008), "Phylogenetic analysis of chloroplast matK gene from Zingiberaceae for plant DNA barcoding", Bioinformation,3 (1),24 Elizabeth and J Czarapata (2005), "Invasive plants of the upper Midwest: an illustrated guide to their identification and control," Univ of Wisconsin Press,43 - 45 Ford, C.S., et al (2009), "Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on land plants", Botanical Journal of the Linnean Society,159 (1),1-11 Frankham, R (2005), "Genetics and extinction", Biological conservation,126 (2),131-140 Gaston, K.J and J.I Spicer (2013), Biodiversity: an introduction, John Wiley & Sons 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Green, A.F., T.S Ramsey and J Ramsey (2011), "Phylogeny and biogeography of ivies (Hedera spp., Araliaceae), a polyploid complex of woody vines", Systematic Botany,36 (4),1114-1127 Grivet, D and R Petit (2002), "Phylogeography of the common ivy (Hedera sp.) in Europe: genetic differentiation through space and time", Molecular Ecology,11 (8),1351-1362 Group, C.P.W., et al (2009), "A DNA barcode for land plants", Proceedings of the National Academy of Sciences,106 (31),12794-12797 Hamayun, M., et al (2006), "Folk medicinal knowledge and conservation status of some economically valued medicinal plants of District Swat, Pakistan", Lyonia,11 (2),101-113 Hashmi, W.J., et al (2018), "Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ+ AlCl induced rats model", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,26 (2),179-190 Hawksworth, D.L (1995), Biodiversity: measurement and estimation, Springer Science & Business Media Hebert, P.D., et al (2003), "Biological identifications through DNA barcodes", Proc Biol Sci,270 (1512),313-21 Hebert, P.D., S Ratnasingham and J.R De Waard (2003), "Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species", Proceedings of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences,270 (suppl_1),S96-S99 Heckenhauer, J., M.H Barfuss and R Samuel (2016), "Universal multiplexable matK primers for DNA barcoding of angiosperms", Applications in plant sciences,4 (6),1500137 Herrera, C (1987), "Vertebrate‐dispersed plants of the Iberian Peninsula: a study of fruit characteristics", Ecological monographs,57 (4),305-331 Hidalgo, O., et al (2004), "Phylogeny of Valerianaceae based on matK and ITS markers, with reference to matK individual polymorphism", Annals of Botany,93 (3),283-293 Hilu, K.W and g Liang (1997), "The matK gene: sequence variation and application in plant systematics", American journal of botany,84 (6),830839 Hollingsworth, M.L., et al (2009), "Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species‐level sampling in three divergent groups of land plants", Molecular ecology resources,9 (2),439-457 Hollingsworth, P.M (2011), "Refining the DNA barcode for land plants", Proceedings of the National Academy of Sciences,108 (49),19451-19452 Hollingsworth, P.M., S.W Graham and D.P Little (2011), "Choosing and using a plant DNA barcode", PloS one,6 (5), Inayatullah, S., et al (2012), "Bioprospecting traditional Pakistani medicinal plants for potent antioxidants", Food chemistry,132 (1),222-229 Ismail, H., et al (2017), "Five indigenous plants of Pakistan with Antinociceptive, anti-inflammatory, antidepressant, and anticoagulant 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 properties in Sprague Dawley rats", Evidence-based Complementary alternative medicine,2017 Ismail, H., et al (2017), "Five Indigenous Plants of Pakistan with Antinociceptive, Anti-Inflammatory, Antidepressant, and Anticoagulant Properties in Sprague Dawley Rats", Evidence-based Complementary alternative medicine,2017 1-10 Ito, M., et al (1999), "Phylogenetic relationships of Amaryllidaceae based on matK sequence data", Journal of Plant Research,112 (2),207-216 Jafri, L., et al (2016), "Hedera nepalensis K Koch: A Novel Source of Natural Cancer Chemopreventive and Anticancerous Compounds", Phytotherapy research,30 (3),447-453 Jafri, L., et al (2017), "In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch", Arabian Journal of Chemistry,10 (2),3699-3706 Jarman S.N and Elliott N.G (2000), "DNA evidence for morphological and cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, ‘living fossils’ from the Triassic", Journal of Evolutionary biology,13 (4),624-633 Jeanson, M.L., J.-N Labat and D.P Little (2011), "DNA barcoding: a new tool for palm taxonomists?", Annals of botany,108 (8),1445-1451 Jukes, T.H and C.R Cantor (1969), "Evolution of protein molecules", Mammalian protein metabolism,3 (21),132 Kanwal, S., et al (2011), "Antioxidant, antitumor activities and phytochemical investigation of Hedera nepalensis K Koch, an important medicinal plant from Pakistan", Pak J Bot,43 (8),85-9 Kimura, M (1980), "A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences", Journal of molecular evolution,16 (2),111-120 Komatsu, K., et al (2001), "Phylogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species", Planta medica,67 (05),461-465 Kress, W.J and D.L Erickson (2007), "A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region", PLoS one,2 (6), Kress, W.J., et al (2009), "Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama", Proceedings of the National Academy of Sciences,106 (44),18621-18626 Kress, W.J., et al (2005), "Use of DNA barcodes to identify flowering plants", Proceedings of the National Academy of Sciences,102 (23),83698374 Lahaye, R., et al (2008), "DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots", Proceedings of the National Academy of Sciences,105 (8),29232928 Larsson, T (2001), "Biodiversity evaluation tools for European forests", Criteria indicators for sustainable forest management at the forest management unit level,75 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 Lei, X., et al (2014), "Prospects and problems for identification of poisonous plants in China using DNA barcodes", Biomedical Environmental Sciences,27 (10),794-806 Manual, I (2017), "Phusion® High-Fidelity PCR Kit", Meng, X and Z Wang (2010), "The volatile constituents analysis of Scindapsus aureum and Hedera nepalensis var sinensis and their inhibition against five fungi", Acta Horticulturae Sinica,37 (6),971-976 Miwa, H., et al (2009), "Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)", Gene,441 (1-2),169-175 Mohr, G., P.S Perlman and A.M Lambowitz (1993), "Evolutionary relationships among group II intron-encoded proteins and identification of a conserved domain that may be related to maturase function", Nucleic Acids Research,21 (22),4991-4997 Nixon, K.C., J.M Carpenter and D.W Stevenson (2003), "The PhyloCode is fatally flawed, and the “Linnaean” system can easily be fixed", The Botanical Review,69 (1),111 Nock, C.J., et al (2011), "Chloroplast genome sequences from total DNA for plant identification", Plant biotechnology journal,9 (3),328-333 Notredame, C., D.G Higgins and J Heringa (2000), "T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment", Journal of molecular biology,302 (1),205-217 Penjor, T., et al (2013), "Phylogenetic relationships of Citrus and its relatives based on matK gene sequences", PloS one,8 (4) Qiao, C.-F., et al (2009), "Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia", Journal of Food Drug Analysis,17 (2) Quattrocchi, U (2012), CRC world dictionary of medicinal and poisonous plants: common names, scientific names, eponyms, synonyms, and etymology (5 Volume Set), CRC press Qureshi, R.A., et al (2009), "Indigenous medicinal plants used by local women in southern Himalayan regions of Pakistan", Pak J Bot,41 (1),19-25 Ravi Prabhakar More, Rupali Chandrashekhar Mane and Hemant J Purohit (2016), "matK-QR classifier: a patterns based approach for plant species identification", BioData mining,9 (1),39 Rubinoff, D., S Cameron and K Will (2006), "A genomic perspective on the shortcomings of mitochondrial DNA for “barcoding” identification", Journal of heredity,97 (6),581-594 Saghai-Maroof, M.A., et al (1984), "Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics", Proceedings of the National Academy of Sciences,81 (24),8014-8018 Saleem, S., et al (2014), "Plants Fagonia cretica L and Hedera nepalensis K Koch contain natural compounds with potent dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory activity", Journal of ethnopharmacology,156 26-32 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 Shaw, J., et al (2005), "The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis", American journal of botany,92 (1),142-166 Shinwari, Z.K (2010), "Medicinal plants research in Pakistan", J Med Plants Res,4 (3),76-161 Sneath, P.H and R.R Sokal (1973), Numerical taxonomy The principles and practice of numerical classification Sokal, R.R., P HA Sneath (1963), Principles of numerical taxonomy WH Freeman, San Francisco, Cali-fornia, USA Stoeckle, M.Y and P.D Hebert (2008), "Barcode of life", Sci Am,299 (4),826, 88 Sui, X.y., et al (2011), "Molecular authentication of the ethnomedicinal plant Sabia parviflora and its adulterants by DNA barcoding technique", Planta medica,77 (05),492-496 Sun, H., W McLewin and M.F Fay (2001), "Molecular phylogeny of Helleborus (Ranunculaceae), with an emphasis on the East Asian‐ Mediterranean disjunction", Taxon,50 (4),1001-1018 Tamura, K (1992), "Estimation of the number of nucleotide substitutions when there are strong transition-transversion and G+ C-content biases", Mol Biol Evol,9 (4),678-687 Tamura, K and M Nei (1993), "Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees", Molecular biology evolution,10 (3),512-526 Tshering Penjor, et al (2013), "Phylogenetic relationships of Citrus and its relatives based on matK gene sequences", PloS one,8 (4) Zhang, J and J Stewart (2000), "Economical and rapid method for extracting cotton genomic DNA", J Cotton Sci,4 (3),193-201 Zhang, Y., et al (2006), "Detection of genetic homogeneity of Panax notoginseng cultivars by sequencing nuclear 18S rRNA and plastid matK genes", Planta medica,72 (09),860-862 ... HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: ĐỖ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (Hedera nepalensis K Koch) Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ matK KHÓA LUẬN... phải thị DNA thích hợp để phân tích đa dạng di truyền lồi Dây thường xn hay khơng? Chính vậy, thực đề tài ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K. Koch) miền Bắc. .. Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân sử dụng mã vạch matK .40 4.2.1 Khoảng cách di truyền 40 4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân