Lan van tot nghiep dai hoc Thien Nhan K34

Gan tụy là nơi bị hoại nặng nhất làm mất chức năng tiêu hóa và gây chết.Trong ương giống, bệnh thường xuất hiện ở môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ, xác bã.Trong sản xuấ[r]

LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, đặc biệt là Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực đề tài này Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tâm hướng dẫn, bảo, dẫn dắt và đóng góp nhiều ý kiến quý báo cho tôi suốt thời gian thực đề tài Tất các thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi quá trình thực đề tài Chị Trương Quỳnh Như đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên suốt quá trình thực đề tài hoàn thành luận văn tốt nghiệp Gia đình và tập thể lớp Bệnh học Thủy Sản - K34 luôn bên cạnh, hỗ trợ và động viên tôi suốt thời gian qua TÓM TẮT Đề tài “ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT Đề tài “ .2 MỤC LỤC .3 Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .7 2.1 Sơ lược tình hình nuôi thủy sản 2.1.1 Trên giới .7 2.1.2 Ở việt Nam 2.2 Tổng quan tôm thẻ chân trắng( Penaeus vannamei Boone, 1931) .9 2.2.1 Đặc điểm phân loại và phân bố .9 2.2.2 Đặc Điểm sinh thái và tập tính sống: 10 2.2.3 Đặc điểm dinh dưỡng và tăng trưởng 10 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm .10 2.4 Sơ lược số bệnh vi khuẩn trên tôm 12 2.4.1 Bệnh vi khuẩn vibrio 12 2.4.2 Bệnh đục tôm càng xanh 13 2.4.3 Bệnh đốm nâu tôm càng xanh 14 2.4.4 Bệnh vi khuẩn dạng sợi Tôm 14 2.4.5 Bệnh đốm trắng vi khuẩn Tôm sú 15 Phần 3: 15 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Vật liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 15 3.1.4 Môi trường: 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Thu mẫu: 16 3.2.2 Làm tiêu kính phết 16 3.2.2 Phân lập vi khuẩn: 17 3.2.4 Định danh vi khuẩn 17 Các chủng vi khuẩn phân lập từ gan tụy tôm TCT định danh dựa vào số tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa Các tiêu này chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại Baumann et al., 1984 Các đặc điểm sinh lý sinh hóa xác định dựa theo cẩm nang Cowan & Steels (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp West & Colwell (1984) Mỗi tiêu xác định ba lần kết ghi nhận là kết có ít lần lặp lại 17 3.2.5 Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002) 19 Phần 4: 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 Phần 5: 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề xuất .29 Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung và Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng phát triển ngày càng nhanh, đã và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn đất nước Nó không mang lại nguồn kim ngạch xuất to lớn cho quốc gia mà còn góp phần đảm bảo an ninh lương thực, xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho người lao động Bên cạnh cá tra, cá basa thì tôm là mặt hàng chủ lực đem nguồn ngoại tệ cho đất nước Trong năm gần đây, ngoài đối tượng nuôi là tôm sú thì tôm TCT xem là đối tượng chủ lực không kém Tôm TCT (P vannamei) cùng với tôm sú (P.monodon) và tôm he Trung Quốc (P chinensis) là ba đối tượng nuôi quan trọng nghề nuôi tôm giới giai đoạn nay.Tôm TCT lần đầu tiên gia nhập vào Việt Nam năm 2000 và phát triển nhiều địa phương như: Ninh Thuận, Phú Yên, Khánh Hòa và lan rộng khắp nước Tính đến hết tháng 6/2008, diện tích nuôi tôm TCT nước ta đã đạt 12.000ha và đã thu hoạch 12.300 Hiện tôm TCT nuôi phổ biến các tỉnh ĐBSCL như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng TCT là đối tượng có giá trị kinh tế cao, thị trường tiêu thụ rộng, thời gian sinh trưởng ngắn (3-3,5 tháng) suất cao (trên tấn/ha) Nhờ có giá trị dinh dưỡng cao mà TCT người tiêu dùng các thị trường lớn ưa chuộng Mỹ là thị trường tiêu thụ tôm TCT lớn sau đó là Châu Âu và Nhật Bản ( Trần Viết Mỹ,2009) Theo thống kê Bộ NN&PTNT, diện tích nuôi TCT năm 2010 là 25.000 ha, sản lượng 135.000T, đem lại 414,6 triệu USD giá trị XK; đó diện tích nuôi tôm sú 613.000 ha, sản lượng 330.000T, đem lại 1.439 triệu USD, có thể thấy TCT nuôi tập trung hơn, đó hiệu sử dụng đất cao nhiều so với tôm sú(http://www.tomgionghvb.com) Do lợi nhuận từ tôm mang lại nên người dân không ngừng mở rộng vùng nuôi, chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền thống sang nuôi bán thâm canh và thâm canh Bênh cạnh suất cao thì dich bệnh bùng phát và trở nên phức tạp Theo báo cáo Cục Thú y, đến cuối tháng 5-2011, nước đã thả nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (TCT) trên 558.000 ha; đó, các tỉnh ĐBSCL thả nuôi trên 547.000 Diện tích thiệt hại tính đến ngày 2/6/2011 tỉnh khu vực ĐBSCL đã lên đến gần 53.000 ha, chiếm gần 10% diện tích thả nuôi và 98% diện tích thiệt hại nước Sóc Trăng là tỉnh có diện tích thiệt hại lớn với trên 19.000 ha, Bạc Liêu có diện tích thiệt hại gần 8.600 ha, Cà Mau và Trà Vinh tỉnh thiệt hại gần 6.600 Theo Tổng cục Thủy sản, tỷ lệ tôm bệnh chết nhiều thuộc vùng nuôi giáp biển Đông với 75,3%, vùng biển Tây thiệt hại 11% và đối tượng nuôi thiệt hại lớn là tôm sú với 60,4%, còn tôm TCT thiệt hại 19,5% (http://cucktbvnlts.gov.vn/) Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh chết trên diện rộng từ năm 1993 đến đã gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế cho người nuôi tôm Các chương trình nghiên cứu liên quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ĐBSCL cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận xuất bệnh đốm trắng White spot syndrome virus (WSSV) (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2003 ) Trong tháng đầu năm 2012, tình hình tôm nuôi bị chết hàng loạt nhiều địa phương khu vực ĐBSCL ngày càng diễn theo chiều hướng phức tạp Cụ thể ỏ Kiên Giang, tính đến thời điểm này toàn tỉnh đã có gần 2.000/80.000 thả nuôi tôm bị thiệt hại dịch bệnh, Cà Mau có 555ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết(http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/68/bnn.aspx) Hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp tính trên tôm xuất ĐBSCL từ năm 2010 và đến năm 2011 bùng phát thành dịch với tổng diện tích thiệt hại 97 nghìn Năm 2012, dịch bệnh tiếp tục phức tạp, với 38.000/622.000 bị thiệt hại, song chưa xác định nguyên nhân(http://tepbac.com).Trước tình hình diễn biến phức tạp dịch bệnh thì việc xác định thành phần loài và vi khuẩn từ gan tụy tôm TCT là việc làm cấp thiết nhằm góp phần làm giảm thiệt hại cho nghề nuôi tôm Vì vậy, đề tài “Xác định thành phần loài và vi khuẩn phân lập từ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Xác định thành phần loài và vi khuẩn phân lập từ tôm thẻ chân trắng làm sở khoa học cho việc phòng và trị bệnh vi khuẩn trên tôm 1.3 Nội dung nghiên cứu - Quan sát gan tụy cảm quan và phết kính - Phân lập và định danh vi khuẩn từ gan tụy tôm thẻ chân trắng 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 1-7/2012 Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi thủy sản 2.1.1 Trên giới Nghề nuôi trồng thủy sản có lịch sử phát triển lâu đời Nhưng nhìn chung, nó thực rõ nét năm gần đây Tổng sản lượng thủy sản tăng nhanh (13% giai đoạn 1985-1995) đạt 116,1 triệu năm 1995 và sau 11 năm tăng lên 144 triệu năm 2006 Sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng nhanh, bình quân 7,6%/năm, với 24,6 triệu năm 1995 (21,2% tổng sản lượng thủy sản trên toàn giới) và 50 triệu vào năm 2006 chiếm 34,7% (Lê Xuân Sinh, 2010) Thực tế cho thấy, năm gần đây nghề nuôi tôm ven biển đã là động lực phát triển kinh tế số quốc gia Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Philippines, Việt Nam và Ecuador (Nam Mỹ) (Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008) Trên giới nay, nghề nuôi trồng thủy sản ngày càng đóng vai trò quan trọng nghiệp phát triển kinh tế xã hội các quốc gia Năm 1975, sản lượng tôm nuôi trên giới là 50.000 lên 200.000 năm 1985, đó khoảng 70% sản lượng tôm đến từ các quốc gia Châu Á Năm 1988, sản lượng tôm nuôi trên giới đạt 450.000 tấn.Từ năm 1995, nghề nuôi tôm trên giới bắt đầu tăng chậm lại dịch bệnh virus xảy trên toàn cầu Tuy nhiên , sản lượng tăng nhiều công nghệ áp dụng, sản lượng tôm toàn cầu năm 1996 đạt 900.000 (FAO, 1999 trích dẫn từ Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004) Đến năm 2000, tổng sản lượng tôm nuôi trên giới đã đạt đến 45,71 triệu ( tăng 6,3% so với năm 1999), năm 2001, đạt 48,42 triệu (FAO, 2001 trích dẫn Lê Xuân Sinh, 2003) Sản lượng nuôi trồng thủy sản giới (bao gồm thực vật thủy sinh) năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn, trị giá 60 tỉ USD tăng 6,1 % sản lượng so với năm 2000 Trong đó sản lượng nuôi trồng thủy sản chủ yếu từ các quốc gia Châu Á chiếm 91,2 % tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản giới Trung Quốc là quốc gia có sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn chiếm 71,2 % năm 2002 (FAO, 2006)( trích dẫn Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008) 2.1.2 Ở việt Nam Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000ha năm 1985 lên đến 295.000 năm 1998 với 30 tỉnh có nuôi tôm sú (Bộ thủy sản 1999) Tình hình phát triển thủy sản Việt Nam trải qua nhiều giai đoạn, ngày càng phát triển sau năm Diện tích nuôi trồng thuỷ sản tăng đặn theo năm suốt từ 1981 tới nay, từ 230 nghìn năm 1981 lên 384,6 nghìn năm 1986 Năm 1981, tổng sản lượng thuỷ sản đạt 596.356 (trong đó khai thác đạt 416.356 tấn, nuôi trồng đạt 180.000 tấn), giá trị kim ngạch xuất đạt 11,2 triệu USD Năm 1986, tổng sản lượng đạt 840.906 (khai thác đạt 598.040 tấn, nuôi trồng đạt 242.866 tấn), kim ngạch xuất thuỷ sản 100 triệu USD Năm 1991, diện tích nuôi trồng thuỷ sản đạt 520.000 ha, sản lượng đạt 335.910 Đến năm 1996 diện tích nuôi trồng thuỷ sản là 585.000ha, sản lượng nuôi trồng đạt 411.000 Năm 2000, diện tích nuôi là 652.000ha, sản lượng đạt 723.110 thì đến năm 2003, tổng sản lượng thuỷ sản đã đạt 2.536.361 (khai thác 1.426.223 tấn, sản lượng nuôi 1.110.138 tấn), giá trị kim ngạch xuất đạt 2.240 triệu USD (Thái Thanh Dương, 2005)( trích dẫn Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008) Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 năm 2000, đến 2005 là 959.900 ha, nuôi tôm công nghiệp và bán công nghiệp 36.559 (Tạp chí Thủy sản, 2006) Sản lượng tôm TCT năm 2002 là 10.000 tấn, năm 2003 là 30.000 (Briggs và ctv), năm 2004 đạt sản lượng 50.000 tấn(FAO,2004) Diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ ĐBSCL chủ yếu tập trung các tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang, Bến Tre Đến năm 2008, tỉnh Cà Mau diện tích nuôi đạt 248.957 ha, Bạc Liêu 125.529 ha, Kiên Giang 90.253 ha, Sóc Trăng 47.918 ha, Bến Tre 35.692 ha, Trà Vinh 56.424 (Bảng 2.1) Bảng 2.1: Diện tích nuôi thủy sản nước mặn, lợ vùng ĐBSCL (đơn vị tính ha) Tỉnh 2004 2008 2005 2006 2007 Long An 5.158 6.135 6.175 6.225 6.281 Tiền Giang 6.430 6.717 6.662 6.767 6.242 Bến Tre 36.955 37.366 35.398 35.858 35.692 Trà Vinh 23.277 27.722 38.209 44.044 56.424 Sóc Trăng 32.842 55.349 48.088 49.526 47.918 Bạc Liêu 115.616 116.791upload.123doc.net.095119.802 125.509 Cà Mau 248.174 248.406 251.856 248.088 248.957 Kiên Giang 69.321 82.936 81.613 84.490 90.253 22 69 27 37 45 Toàn vùng 537.795 581.491 586.123 595.577 617.341 Hậu Giang (Nguồn: Sở thủy sản, Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008) 2.2 Tổng quan tôm thẻ chân trắng( Penaeus vannamei Boone, 1931) 2.2.1 Đặc điểm phân loại và phân bố Phân loại: Ngành: Arthropoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Bộ: Decapoda (Mười chân) Họ: Penaeidae (Tôm he) Giống: Litopenaeus Loài: Litopenaeus vannamei Boone, 1931 hay Penaeus vannamei Boone, 1931 Tên tiếng Anh: White leg shrimp Tên tiếng Việt: Tôm bạc Thái Bình Dương, Tôm chân trắng (theo FAO), Việt Nam thường gọi là Tôm chân trắng.(Trần Viết Mỹ,2009) Phân bố: Tôm thẻ chân trắng là loài địa đông Thái Bình Dương từ Sonora Mexico đến bắc Peru Phân bố chủ yếu Châu Mỹ La Tinh, Hawaii, nuôi nhiều nước trên giới như: Đài Loan, Trung Quốc, Việt Nam.(http://vi.wikipedia.org) 2.2.2 Đặc Điểm sinh thái và tập tính sống: Sinh thái: Tôm chân trắng là loài tôm nhiệt đới, có khả thích nghi với giới hạn rộng độ mặn và nhiệt độ Tôm có khả thích nghi với độ mặn 0,5 – 45 ‰, thích hợp: – 34 ‰ và tăng trưởng tốt độ mặn khá thấp: 10– 15 ‰.Nhiệt độ thích hợp cho phát triển tôm là 23 – 30°C Nhiệt độ tối ưu cho tôm lúc nhỏ (1g) là 30°C và cho tôm lớn (12 –18g) là 27°C Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ thấp tôm mẫn cảm với các bệnh virus bệnh đốm trắng và hội chứng Taura Tập tính sống: Trong vùng biển tự nhiên, tôm chân trắng nơi có đáy cát bùn, độ sâu < 72m, tôm trưởng thành phần lớn sinh sống ven biển gần bờ, tôm phân bố nhiều vùng cửa sông - nơi giàu chất dinh dưỡng.Tôm kiếm ăn vào ban đêm.Ban ngày vùi mình bùn Trong điều kiện thí nghiệm, ít thấy tôm ăn thịt lẫn 2.2.3 Đặc điểm dinh dưỡng và tăng trưởng Dinh dưỡng: Tôm chân trắng là loài ăn tạp thiên động vật, phổ thức ăn rộng, cường độ bắt mồi khỏe, tôm sử dụng nhiều loại thức ăn tự nhiên có kích cỡ phù hợp từ mùn bã hữu đến các động thực vật thủy sinh Nhu cầu protein phần thức ăn cho tôm chân trắng (20 – 35%), thấp so với các loài tôm nuôi cùng họ khác (36 – 42%) Theo Thái Bá Hồ-Ngô Trọng Lư (2003) khả chuyển hóa thức ăn tôm TCT là cao, điều kiện nuôi lớn bình thường, lượng cho ăn cần 5% thể trọng tôm Tăng trưởng: Tôm có tốc độ tăng trưởng nhanh, điều kiện nuôi, với môi trường sinh thái phù hợp, tôm có khả đạt - 10g 60 - 80 ngày, hay đạt 35 - 40g khoảng 180 ngày Tôm tăng trưởng nhanh 60 ngày nuôi đầu Sau đó, mức tăng trọng giảm dần theo thời gian nuôi Tôm chân trắng lột xác vào ban đêm, thời gian lần lột xác khoảng – tuần, tôm nhỏ (< 3g) trung bình tuần lột xác lần, thời gian lần lột xác tăng dần theo tuổi tôm, đến giai đoạn tôm lớn (15 – 20g), trung bình 2,5 tuần tôm lột xác lần 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm Ngay từ năm đầu thập niên 90 cùng với phát triển nghề nuôi tôm công nghiệp "dịch bệnh" tôm Việt Nam bắt đầu xuất Theo thống kê Bộ Thủy sản (1995) từ năm 1993 – 1995 dịch bệnh tôm đã báo động 10 trên toàn quốc làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5225 trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến dịch bệnh tồn và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng Thiệt hại lớn là đồng sông Cửu Long Tôm dễ mắc bệnh và thường bị chết vào khoảng 1.5 đến tháng tuổi (http://www.vietlinh.vn/library/aquaculture_doctor/sh99.htm) Trong năm 2008, ĐBSCL có 148.000 tôm bị chết, tập trung Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Sóc Trăng 28.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha(Huỳnh Thế Anh,2010) Tại tỉnh Kiên Giang tháng đầu năm 2010 đã thiệt hại trên 10.000 tôm nuôi trên đất lúa các huyện thuộc vùng U Minh Thượng, xâm nhập mặn lấn sâu vào nội đồng, nhiều nông dân phải thu hoạch sớm để bù vào chi phí bỏ đầu vụ Tình trạng tôm chết đột ngột Sóc Trăng diễn nhanh, diện tích thiệt hại tăng cách nhanh chóng Không là mô hình nuôi quảng canh cải tiến, lần này đến lượt các diện tích nuôi công nghiệp và bán công nghiệp với kỹ thuật nuôi tiên tiến bị thiệt hại nặng Theo Hiệp hội Tôm Mỹ Thanh, diện tích thiệt hại chủ yếu ao tôm 80 ngày tuổi trở lại.Bảy tháng đầu năm 2010 tỉnh Sóc Trăng đã trên 5.000 ha, tập trung chủ yếu huyện Vĩnh Châu, Trần Đề Các kết xét nghiệm mẫu chưa xác định tác nhân gây bệnh Theo ông Khởi, diện tích thiệt hại tới đây có thể lên đến 18-20% diện tích nuôi không dừng lại mức trên 11% Theo các chuyên gia Viện trưởng Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, tác nhân gây bệnh tôm chết có thể ký sinh trùng và vi khuẩn công phá vỡ gan tôm Còn theo người nuôi tôm khu vực Trần Đề, dịch bệnh tôm sú có thể lây lan từ nguồn nước xả trực tiếp môi trường ao nuôi tôm thẻ chân trắng bị thiệt hại (Nguồn: Sở NN&PTNT tỉnh Sóc Trăng) Theo Vụ Nuôi trồng Thủy sản (Tổng cục Thủy sản), tính từ đầu năm đến nước có 81.782 nuôi tôm bị thiệt hại, 294% so cùng kỳ năm 2010, đó tôm sú là 78.849 và tôm thẻ chân trắng (TTCT) là 2.933 Tỉnh Sóc Trăng bị thiệt hại nặng nề nhất, chủ yếu trên vùng nuôi thâm canh và bán thâm canh với 28.477 ha, cao cùng kỳ 21.233 ha, chiếm 67% diện tích thả nuôi Tiếp đến Bạc Liêu bị thiệt hại hai vụ là 16.500 Đáng nói, nhiều chủ trang trại dù đã xử lý ao, thả lại tôm giống bị thiệt hại dịch bệnh tái diễn 11 Trong tháng đầu năm 2012,tại Cà Mau tình hình tôm chết diễn biến phức tạp Theo báo cáo Sở NN-PTNT tỉnh Cà Mau, tính đến thời điểm này toàn tỉnh đã có 555ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết Trong đó tập trung nhiều các huyện Đầm Dơi (với 234 tôm chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nước (67 ha) và TP Cà Mau (38 ha) Tình hình tôm nuôi bị chết đã khiến cho nông dân các vùng trọng điểm nuôi tôm công nghiệp Cà Mau hoang mang Tại tỉnh Bạc Liêu, diện tích tôm chết tăng vọt Thống kê đây ngành nông nghiệp tỉnh này cho biết, đã có trên 1.270 tôm nuôi bị chết, ước tính thiệt hại lên đến hàng tỉ đồng.Tại Sóc Trăng,theo ông Nguyễn Văn Khởi - Phó Giám đốc Sở NN PTNT tỉnh Sóc Trăng: Trong tháng 2/2012, toàn tỉnh thả giống có 1.200ha tôm thẻ chân trắng đã bị thiệt hại đến trên 500ha (http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/68/bnn.aspx) 2.4 Sơ lược số bệnh vi khuẩn trên tôm 2.4.1 Bệnh vi khuẩn vibrio Bệnh số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp đã công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng số đối tương nuôi thủy sản (Austin & Austin 1993) Bên cạnh Vibrio anguillarum và V ordalii xem là tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm Vibrio spp., số loài thuộc nhóm này công bố là tác nhân gây bệnh số đối tượng nuôi thủy sản quan trọng (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006) Vibrio spp là dạng vi khuẩn bắt màu gram âm, hình chữ v dấu phẩy, di động, hiếu khí kỵ khí không bắt buộc Có thể tồn nhiều độ mặn khác phát triển tốt là 20 – 40‰ (Đỗ thị Hòa et al., 2004) Có loài phát triển độ muối – 8‰ V parahaemolitycus và V alginolyticus và ppt là: V fluvialis, V furinissii và V anguillarum (Cowan et al., 1987) Vibrio spp là nhóm vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, nhiệt độ phát triển thích hợp là 25 – 30C Dạng màu sắc khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặc trưng TCBS chia làm nhóm: nhóm có khả lên men đường succrose có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả lên men đường succrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây (trích dẫn Châu Ngọc Sơn, 2008) Một số loài vi khuẩn Vibrio có khả phát sáng Vibrio harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri, Vibrio vulnificus Trong đó, V harveyi đã xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng trai ngọc Pinctada maxima, 12 Tôm sú Penaeus monodon và tôm he Nhật Penaeus japonicus (Pass et al 1987; Lavilla-Pitogo et al., 1990; Karunasagar et al., 1994; Liu et al., 1996; Leano et al 1998) Bệnh nhóm vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế nuôi tôm công nghiệp Philipines, Ấn Độ và Indonesia Các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi có liên quan đến bệnh vi khuẩn chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây Ở Việt Nam, dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy trại sản xuất ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng bóng tối Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể tôm trưởng thành (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006) Bảng 2.2: Một số bệnh tôm vi khuẩn vibrio gây STT Tên bệnh Bệnh phát sáng Giai đoạn tôm Ấu trùng, giống Bệnh đỏ dọc thân Ấu trùng, giống Bệnh đỏ thân, đỏ Các giai đoạn chân hay bệnh ăn tôm cua mòn vỏ kitin Bệnh đen mang Tôm thịt Vi khuẩn gây bệnh V parahaemoliticus V harveyi V alginolyticus Tác hại gây chết hàng loạt gây chết rải rác gây chết rải rác Vibrio spp Pseudomonas spp Proteus sp Vibrio spp và số vi gây chết khuẩn khác rải rác hàng loạt (Nguồn Bùi Quang Tề, 2003) Tôm nhiễm bệnh bị yếu và màu trắng đục Tôm chết thường trên mặt nước hay ven mé Tôm nhiễm bệnh nặng phát sáng bóng tối, bỏ ăn, lắng xuống đáy bể thành thảm sáng xanh đáy, chết hàng loạt và nhanh đến 80-100% Quan sát hay máu tôm chết cho thấy có nhiều vi khuẩn di động Gan tụy là nơi bị hoại nặng làm chức tiêu hóa và gây chết.Trong ương giống, bệnh thường xuất môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ, xác bã.Trong sản xuất giống, mầm bệnh lây truyền chủ yếu từ ruột tôm bố mẹ cho ấu trùng giai đoạn sinh sản (Trần Ngọc Hải và ctv, 2000).Ấu trùng nhiễm bệnh thường có màu đen trên đỉnh các phụ bộ, tôm bỏ ăn, ruột rỗng Tôm chết dần, đôi chết 100% (Từ Thanh Dung và ctv., 2005) 2.4.2 Bệnh đục tôm càng xanh Tác nhân gây bệnh là cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococus seriolicida ) gam dương,hình trứng Vi khuẩn phát triển nhiệt độ 10- 13 40ºC Độ muối từ 0.5-0.6%,pH 9,6 (theo Winton Cheng, Jiann-Chu Chen, 1988-2001) Khi nhiễm bệnh tôm kém ăn, hoạt động chậm chạp, đầu tiên phần đuôi chuyển sang màu trắng đục, sau đó lan dần lên phần đầu ngực Bị nặng mang chuyển màu trắng đục,vỏ tôm mềm, tỉ lệ chết cao Chuẩn đoán bệnh dựa vào dấu hiệu bệnh lí và phân lập vi khuẩn để xác định bệnh.(Bùi Quang Tề, 2003) 2.4.3 Bệnh đốm nâu tôm càng xanh Theo Bùi Quang Tề(2006) thì tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn Aeromonas hydrophila.Là loài vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, hai đầu tròn, kích thước 0,5x1.0-1,5µm Vi khuẩn dạng yếm khí tùy tiện, Cytochrom oxidase dương tính Tôm bị bệnh thương yếu, hoạt động chậm chạp và nằm yên đáy, kém ăn bỏ ăn.Trên các phụ bộ, vỏ có các vết ăn mòn chuyển từ nâu sang đen và các phần phụ cụt dần Phía vỏ kitin có đốm đen Trên vỏ và phần phụ có nhiều sinh vật bám Bệnh thường gặp tôm càng xanh nuôi thương phẩm, tỉ lệ nhiễm từ 10-30% càng cuối chu kỳ nuôi tỷ lệ nhiễm bệnh gia tăng Những ao nuôi nước nhiễm bẫn tỷ lệ nhiễm bệnh là 60-70% và có tượng tôm chết rải rác Bệnh thường xuất từ tháng thứ cuối chu kỳ nuôi 2.4.4 Bệnh vi khuẩn dạng sợi Tôm Tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix mucor ngoài có thể gặp số vi khuẩn dạng sợi khác: Thiprix sp., Flexibacter sp., Cytophaga sp., và Flavobacterium sp các vi khuẩn này có thể độc lập phối hợp với gây bệnh tập chung nhiều mang, thân và các phần phụ Các vi khuẩn dạng sợi thuộc họ Flexibacteraceae coa giai đoạn tế bào dinh dưỡng, chúng không hình thành bào tử, sống tự nước biển và cửa sông, có thể bám trên bề mặt nhiều loài động vật thủy sinh,phân giải xenlulose, kitin và nhiều hợp chất hữu cơ.(Bùi Quang Tề, 2006) Tôm mắc bệnh dạng sợi thường yếu, hoạt động khó khăn Quan sát trên KHV với độ phóng đại 100x có thể nhìn rõ vi khuẩn trên bề mặt thể, đặc biệt là đầu mút các phần phụ, tôm lớn vi khuẩn phát triển chân bơi,râu, phận phụ miệng, trên mang.Khi tôm bị nhiễm bệnh nặng mang đổi từ màu vàng sang xanh nâu.Lúc đó tôm lờ đờ, bỏ ăn khó lột xác và chết hàng loạt.(Bùi Quang Tề,2006) Ở trứng nhiễm bệnh vi khuẩn bám thành thảm dày trên vỏ, làm cản trở hô hấp hay nở trứng Ngoài ra, ấu trùng và tôm bột vi khuẩn phát triển trên bề mặt thể, là trên các lông và phụ Ở tôm lớn, vi khuẩn diện trên các lông tơ chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vẩy râu, phụ miệng và mang Tôm nhiễm nặng, mang xuất màu 14 vàng đến xanh Vi khuẩn dạng sợi gây cản trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây chậm lớn hay gây chết tôm (Từ Thanh Dung, 2011) Bệnh thường gặp giai đoạn ấu trùng Mysis và Postlarvae tôm he.Ở Việt Nam, khu vực ương ấu trùng tôm biển Miền Trung vi khuẩn dạng sợi xuất nhiều giai đoạn Mysis 2-3 và giai đoạn Postlarvae nuôi mật độ dày, môi trường môi trường đáy bẩn tích tụ thức ăn nhiều Các ao ương giống và nuôi tôm thịt thường gặp khá phổ biến vi khuẩn dạng sợi, hàm lượng hữu ao quá lớn và nuôi mật độ dày (Bùi Quang Tề,2006) 2.4.5 Bệnh đốm trắng vi khuẩn Tôm sú Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả là nguyên nhân gây bệnh đốm trắng (Wang et al,2000) tôm sú nuôi Malaysia Vibrio cholerae nuôi cấy từ mẫu bệnh tôm nuôi Thái Lan và có thể xem là nguyên nhân hội thứ hai.Ở Việt Nam đã nuôi cấy Vibrio spp từ các mẫu tôm sú nuôi.(Bùi Quang Tề và ctv, 2004) Tôm bệnh có các đốm trắng mờ đục nhìn thấy trên vỏ khắp thể, bóc vỏ thì nhìn thấy rõ Đốm trắng hình tròn nhỏ đốm trắng bệnh virus Soi mẫu tươi kính hiển vi đốm trắng có dạng lan tỏa hình địa y rỗng( có tượng ăn mòn) khác với đốm trắng virus có đốm đen (melamin) Các đốm trắng thường phía ngoài lớp biểu bì và tổ chức liên kết ít nguy hiểm với tổ chức phía Đốm trắng có thể tôm lột vỏ(Wang et al,2000) Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu bất thường thu các ao nuôi tỉnh Sóc Trăng 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, tiểu phẩu, khay nhựa Ống nghiệm, giá ống nghiệm,ống đong Lame, lamella, đĩa Petri, giấy nhôm Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi Chai nấu môi trường 100ml, 250ml, 500ml,cá từ 15 Micropipet 1ml, micropipet 5ml Đầu col 1ml và 5ml, ống hút, ống eppendorf, găng tay Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh Bếp nấu môi trường, nồi trùng Cân điện từ, lò viba, máy ly tâm, máy chụp hình UV Các vật liệu khác… 3.1.3 Hóa chất - Cồn tuyệt đối, cồn 96º, NaCl, H2O2, vaselin, paraffin, Oxidase thương mại - Ethanol, Crystal violet, ammonium oxalate, iodine, alcohol, acetone, safranin, nước cất - Kit API 20E (BioMérieux) - Dùng12 loại kháng sinh để lập kháng đồ : Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10µg), Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg), Amoxicillin (AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg) (Nguồn từ công ty Bio-rad và Oxoid) 3.1.4 Môi trường: -Môi trường thạch: Tryptic soy agar (TSA)(+1,5% NaCl), Trytic soya broth (TSB)(+1,5% NaCl), Muller hinton agar (MHA)(+1,5% NaCl), Thiosulfat Citrate Bile Salt Succo agar(TCBS)(+1,5% NaCl) -Môi trường lỏng: Tryptic soy broth(TSB)(+1,5% NaCl), Nutrient broth (NB) (+1,5% NaCl) -Môi trường OF (oxidation-fermentation medium) 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thu mẫu: Tôm TCT vận chuyển từ Sóc Trăng phòng thí nghiệm.Mẫu thu là mẫu tôm giống còn sống chứa túi nylon có bơm oxy, mẫu thu 3.2.2 Làm tiêu kính phết - Dùng ben tiệt trùng lấy ít gan tụy lên lame - Nhỏ giọt dung dịch Davidson’s không chứa acid acetic lên mẫu và phết lên lame - Để khô nhiệt độ phòng - Cố định 1% glacial acetic acid thời gian phút - Để ngăn mát (nếu chưa nhuộm liền) 16 - Nhuộm Gram tiêu và quan sát KHV(Phương pháp nhuộm xem Phụ lục 1) 3.2.2 Phân lập vi khuẩn: -Khử trùng mặt ngoài thể tôm cồn 70º,rửa lại nước muối sinh lý (0.85% NaCl) - Dùng ben tiệt trùng lấy ít gan tụy cấy trên đĩa môi trường NA+ - Đặt các đĩa này tủ ấm nhiệt độ 28ºC sau 24 Quan sát ghi nhận màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc - Nếu đĩa cấy chưa thì ta tiến hành tách ròng lại có đĩa cấy - Các chủng vi khuẩn trữ -80°C môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa 15% glycerol và 1% (w/v) NaCl 3.2.4 Định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn phân lập từ gan tụy tôm TCT định danh dựa vào số tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa Các tiêu này chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại Baumann et al., 1984 Các đặc điểm sinh lý sinh hóa xác định dựa theo cẩm nang Cowan & Steels (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp West & Colwell (1984) Mỗi tiêu xác định ba lần kết ghi nhận là kết có ít lần lặp lại Định danh vi khuẩn phương pháp truyền thống: - Cần phải kiểm tra tính ròng chủng vi khuẩn trước định danh cách quan sát các khuẩn lạc có cùng màu sắc và hình dạng trên cùng đĩa agar Sau đó quan sát tiêu nhuộm Gram kính hiển vi vật kính 100x có giọt dầu Khi thấy các tế bào vi khuẩn trên cùng lame mẫu phải đồng màu sắc(màu tím/xanh màu hồng/đỏ) và hình dạng (que ngắn, que dài, hình cầu…) - Tiến hành test các tiêu sinh lý, sinh hóa vi khuẩn (phụ lục 1) +Kiểm tra tính di động + Phản ứng Oxidase + Phản ứng Catalase + Khả lên men và oxy hóa đường Glucose (O/F test) + Phản ứng O/129 Định danh vi khuẩn kit API20E - Chuẩn bị: + Cho ít nước cất vào khuôn nhựa kít để giữ ẩm suốt quá trình ủ tủ ấm + Đặt kít API20E vào khuôn nhựa 17 - Pha dung dịch vi khuẩn: Dùng que tiệt trùng lấy ít khuẩn lạc cho vào ml nước muối sinh lý nước cất tiệt trùng, lắc - Thực hiện: Dùng pipette với đầu cone tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào ô kít + Cho vi khuẩn vào đầy các ô CIT, VP và GEL + Cho vi khuẩn vào đầy các ô ( ½ ô -dưới) ADH, LDC, ODC, H2S và URE, cho dầu paraffin tiệt trùng vào đầy (½ô-trên) các ô này + Cho vi khuẩn vào ½ các ô còn lại + Đậy nắp khuôn nhựa và ủ tủ ấm 26-28ºC và đọc kết sau 24 - Kết quả: + Cho giọt thuốc thử TDA vào ô TDA + Lần lược cho giọt thuốc thử VP1 và giọt thuốc thử VP2 vào ô VP + Cho giọt thuốc thử IND vào ô IND Bảng 3.1: Thành phần kết kiểm tra kít API 20E (BioMérieux) Chỉ Chất Phản ứng/ enzyme Âm tính Dương tính tiêu ONPG ADH LDC ODC CIT Ortho-nitrophenyl galactosidase Arginine Lysine Ornithine Sodium citrate Beta-galactosidase Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Citrate utilisation Không màu Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Đỏ/cam Cam Đỏ Xanh/xanh H2S URE TDA IND VP Sodium Thiosulphate Urea Tryptophane Tryptophane Sodium Pyruvate H2S production Urease Tryptophane deaminase Indole production Acetoin production Không màu Vàng Vàng Vàng Không màu lá Đen Đỏ/cam Nâu sậm Đỏ (2 phút) Hồng/đỏ (10 GEL Gelatin Gelatinase Kết tủa đen giây) Màu đen hòa GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA Glucose Mannitol Inositol Sorbitol Rhamnose Sucrose Melibiose Amygdalin Arabinose Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá Xanh/xanh lá tan Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng 3.2.5 Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002) Lập kháng sinh đồ vi khuẩn với 12 loại kháng sinh là Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10µg), 18 Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg), Amoxicillin (AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg) Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số (9x108 cfu/ml) - Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng Trộn và so sánh độ đục với ống McFarland số (9,7ml 1% H2SO4 và 0,3ml 1% BaCl2) Nếu độ đục thấp ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn lạc vào, ngược lại độ đục cao thì cho nước muối sinh lý vào độ đục ngang với ống chuẩn McFarland Khi đó mật độ vi khuẩn ống nghiệm khoảng x 108 cfu/ ml Sau đã xác định mật số vi khuẩn phương pháp trên thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch cách dùng pipet tiệt trùng hút 0.1ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA có bổ sung 1,5% NaCl Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đến vừa khô Sau đó để yên khoảng phút dùng pel tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri cho khoảng cách hai tâm đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24mm và khoảng cách tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10-15mm Mỗi đĩa thạch dán loại kháng sinh Sau hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm 28 ºC Đọc kết sau 24 Đọc kết Đo đường kính vô trùng (mm) và dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng nhà sản xuất (Bảng 3.1) để xác định loại thuốc kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng Bảng 3.2 Các kháng sinh dùng nghiên cứu kháng sinh đồ Kháng sinh Chuẩn đường kính vòng vô trùng (Công ty Biorad & Oxoid) Kháng Trung bình Neomycin (N/30µg) ≤12 13 – 16 Florfenicol (FFC/30 µg) ≤16 17 – 19 Ciprofloxacin (CIP/5µg) ≤15 16 – 20 Gentamicin (GM/10µg) ≤12 13 – 14 Doxycycline (DO/30µg) ≤12 13 – 15 19 Cefazolin (CZ/30µg) ≤14 15 – 17 Ampicillin (AMP/25µg) ≤13 14 – 17 Amoxicillin (AML/25µg) ≤13 14 – 17 Trimethoprim+Sulfamethoxazole ≤10 11 – 15 Tetracycline (TE/30µg) ≤14 15 – 18 Norfloxacin (NOR/5µg) ≤12 13 – 16 Enrofloxacine (ENR/5µg) ≤16 17 – 22 (SXT/1.25/23.75µg) (Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011) Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết mẫu kính phết: 4.2.Kết phân lập và định danh vi khuẩn Phân lập vi khuẩn từ gan tụy 39 mẫu tôm TCT (13 ao) và cấy trên môi trường NA+ Ủ nhiệt độ 28oC, sau 24 thu 21 chủng vi khuẩn, dựa vào đặc điểm hình dạng khuẩn lạc đã chia chúng thành nhóm chính: Nhóm 1: Vi khuẩn phát triển trên môi trường NA + sau 24 28oC, dạng khuẩn lạc tròn, trắng đục, nhỏ li ti đến 1mm Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên môi trường NA + sau 24 28oC, dạng khuẩn lạc tròn, trắng đục, kích thước 2-5mm Tiến hành tách ròng các nhóm khuẩn lạc các dòng Sau đó thực kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhóm 1(Bảng 4.1) và nhóm 2(bảng 4.2) nhuộm Gram, hình dạng, tính di động, phản ứng Oxidase, phản ứng Catalase, khả lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), phản ứng O/129(trừ nhóm 1) Kết kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá các chủng vi khuẩn đề tài trình bày Bảng 4.1 và 4.2 Bảng 4.1: Các tiêu 11 chủng vi khuẩn nhóm 20 Chỉ tiêu O/F Gram Hình dạng Di động Oxidase Catalase Chủng O F A4L2G1-2b + Cầu - - + + + A4L3G1-2b + Cầu - - + + + A14C1G-b + Cầu - - + + + A14C2G + Cầu - - + + + A24C1G1-a + Cầu - - + + + A24C1G-b + Cầu - - + - - A25L3G3-1b + Cầu - - + + + A25L3G1-1b + Cầu - - + + + A25L3G3-1a + Cầu - - + + + A25L3G1-1a + Cầu - - + + + A1L2G3 + Cầu - - + + + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính Theo bảng kết test các tiêu sinh lý, sinh hoá (Bảng 4.1) các dòng vi khuẩn xác định thuộc giống Micrococus spp và Staphylococcus spp là vi khuẩn hình cầu, gram dương , phát triển trên môi trường NA+ sau 24-48h, không di động, catalase dương tính, oxidase âm tính Đồng thời vừa có khả lên men yếm khí, vừa cho khả lên men hiếu khí.(hình 4.1) Kết này phù hợp với hệ thống phân loại Baumann et al., 1984 là hình cầu,gram dương Theo Bùi Quang Tề(2006) Staphylococcus spp là dạng cầu khuẩn, không có tiêm mao và không có khả di động 21 A B C Hình 4.1: Chủng vi khuẩn thuộc giống Micrococus spp và Staphylococcus spp phân lập trên gan tụy tôm TCT (A) Khuẩn lạc trên môi trường NA+, (B) Hình dạng vi khuẩn (Gram dương, hình cầu) (100X), (C) Phản ứng O/F dương tính Bảng 4.2: Các tiêu 10 chủng vi khuẩn nhóm Chỉ tiêu O/F Gram Hình dạng Di động Oxidase Catalase O/129 O Chủng F A8C1G - Que - - + - - - A10C2G - Que + - + + + + A24C3G-b - Que - - + - - - 22 A24C3G-a - Que + - + - - - A8C3G - Que + - + - + - A10L2G1 - Que + - + - - A12C1G - Que + + + + - + A2C2G - Que + + + - + + A2C3G3-b - + - A3C3G3-a - - + Que Que + + + + + - + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính Dựa vào kết các tiêu sinh lý, sinh hóa Bảng 4.2, cho thấy có chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae đó là chủng gram âm, hình que, oxidase âm tính, catalase dương tính, di động không di động, âm tính với O/F và O/129 Theo Từ Thanh Dung và ctv(2005) Vi khuẩn E ictaluri là loài vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceace, gram âm,hình que ngắn, di động yếu không di động Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men đường glucose Còn lại chủng thuộc giống vibrio spp gram âm, hình que, di động, cho phản ứng dương tính với Oxidase,phát triển trên môi trường NA+ và môi trường TCBS Kết các tiêu sinh hóa chủng A12C1G, A3C3G3-a phù hợp với các tiêu điển hình giống Vibrio gram âm, hình que, có khả lên men glucose , mọc trên môi trường chọn lọc cho nhóm Vibrio (Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose-TCBS),nhạy với hợp chất 2,4-diamino6,7-diisopropyl pteridine (O/129,150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas (West et al.1986) Sau kiểm tra các đặc điểm sinh hóa các chủng Bảng 4.2 đã tiến hành định danh kít API20E Kết có chủng đã định danh mức độ loài và chủng không cho kết Cụ thể là hai chủng A12C1G và A3C3G3-a thuộc loài Vibrio Vulnificus (Bảng 4.3) Bảng 4.3: Kết định danh chủng vi khuẩn Vibrio spp kít API 20E ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL A2C3G-a + + + + + A12C1G + + + + 23 - GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX + + + + + + + + + + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính 4.1 Kết kháng sinh đồ: Từ nguồn vi khuẩn phân lập trên gan tụy tôm TCT qua ba đợt thu mẫu Sóc Trăng, đã chọn 10 chủng vi khuẩn Gram âm, hình que Kết kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn và 12 loại kháng sinh thể Bảng 4.2 Bảng 4.2: Đường kính vòng tròn vô trùng 10 chủng vi khuẩn Vi Khuẩn A8C 3G A2C 2G A8C 1G A10 C2G 26 25 29 23 23 21 11 21 14 14 29 18 25 25 12 17 26 23 21 27 21 11 19 17 23 23 28 18 25 26 11 16 26 A2C A24C 3G3a 3G-a A10L 2G1 A12 C1G A3C3 G3 A24C 3G-b 18 19 23 15 26 28 15 17 29 29 31 24 21 21 19 19 20 28 31 30 22 23 12 30 25 22 20 28 28 22 32 28 29 23 27 34 17 23 29 Kháng sinh DO TE FFC SXT ENR AMP CIP CZ N AML NOR 24 23 24 16 21 21 13 15 20 26 22 28 25 28 24 24 34 18 22 21 24 GM 17 16 10 14 16 14 17 17 16 (Đơn vị mm) - Từ kết kháng sinh đồ cho thấy có chủng vi khuẩn nhạy với DO, TE chiếm 90%, ngoại trừ chủng A2C2G có mức độ nhạy trung bình với loại kháng sinh - Tất 10 chủng nhạy với FFC, CIP và NOR - Có chủng nhạy với SXT, chủng A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình, chủng A8C1G và A8C3G kháng hoàn toàn với SXT - Có chủng nhạy với ENR, chủng A2C3G3a và A12C1G nhạy trung bình với ENR, chủng A8C1G kháng với ENR - Đối với kháng sinh AMP có chủng A24C3Ga và A24C3Gb là nhạy, chủng còn lại kháng với AMP - Đối với CZ nhạy với chủng A24C3Ga, A24C3Gb, A12C1G và A3C3G3, chủng còn lại kháng với CZ - Đối với N có chủng nhạy với kháng sinh, chủng A2C3G3a, A10C2G, A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình - Có chủng A24C3Ga, A3C3G3 và A24C3Gb nhạy với AML, chủng còn lại tất kháng - chủng A8C3G, A10C2G kháng với GM, chủng A2C3G3a và A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình, chủng còn lại nhạy với GM NOR GM N AML Hình 4.3: Đĩa kết kiểm tra kháng sinh đồ với chủng vi khuẩn trên TCT, GM: Gentamicin, NOR: Florfenicol, N: Neomycin, AML: Amoxicillin 25 Bảng 4.2 Sự mẫn cảm 10 chủng vi khuẩn với 12 loại kháng sinh Kháng sinh Kháng Trung bình Nhạy Doxycycline (DO/30µg) 0/10 1/10 9/10 Tetracycline (TE/30µg) 0/10 1/10 9/10 Florfenicol (FFC/30 µg) Trimethoprim+Sulfamethoxazole 0/10 0/10 10/10 2/10 1/10 7/10 Enrofloxacine (ENR/5µg) 1/10 2/10 7/10 Ampicillin (AMP/25µg) 8/10 0/10 2/10 Ciprofloxacin (CIP/5µg) 0/10 0/10 10/10 Cefazolin (CZ/30µg) 6/10 0/10 4/10 Neomycin (N/30µg) 0/10 3/10 7/10 Amoxicillin (AML/25µg) 7/10 0/10 3/10 Norfloxacin (NOR/5µg) 0/10 0/10 10/10 Gentamicin (GM/10µg) 2/10 2/10 6/10 ≤10 11 – 15 ≥16 (SXT/1.25/23.75µg) Theo kết bảng 4.2 cho thấy phần lớn các loại kháng sinh có tỉ lệ nhạy cao, có loại kháng sinh kháng với vi khuẩn nhiều là: APM (80%), AML (70%) và CZ (60%) Xét trên nhóm nhạy thì kháng sinh FFC, CIP, NOR có tỉ lệ nhạy cao (100%), là kháng sinh DO và TE có tỉ lệ nhạy là 90%, loại kháng sinh có tỉ lệ nhạy 70% là SXT, ENR và N, còn lại là kháng sinh GM có tỉ lệ nhạy là 60% 26 Hình: Tỉ lệ chủng vi khuẩn kháng với các loại kháng sinh Ghi chú: 1: Doxycycline, 2: Tetracycline, 3: Florfenico, : Trimethoprim + Sulfamethoxazole, 5: Enrofloxacine, 6: Ampicillin, 7: Ciprofloxacin, 8: Cefazolin, 9: Neomycin, 10: Amoxicillin, 11: Norfloxacin, 12: Gentamicin Kết hợp kết từ bàng 4.1 và 4.2 cho thấy có đa kháng thuốc trên số chủng vi khuẩn Cụ thể là chủng A8C3G kháng với loại kháng sinh SXT, AMP, CZ, AML và GM Chủng A2C2G kháng với loại kháng sinh AMP, CZ và AML Chủng A8C1G kháng loại kháng sinh SXT, ENR, AMP, CZ và AML Chủng A10C2G kháng loại kháng sinh AMP, CZ, AML và GM Hai chủng A2C3G3b và A10L2G1 kháng kháng sinh AMP, CZ và AML, cuối cùng là chủng A12C1G kháng hoàn toàn với AMP và AML Từ kết trên nhận thấy có 20% chủng kháng kháng sinh, 10% kháng với loại kháng sinh, 30% kháng kháng sinh và 10% kháng với loại kháng sinh Hình: Tỉ lệ các chủng vi khuẩn đa kháng với nhiều loại kháng sinh Một số nghiên cứu cho thấy tượng đa kháng thuốc vi khuẩn phân lập từ các ao nuôi thủy sản là vấn đề xảy phổ biến Theo 27 Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) kết kháng sinh đồ 26 dòng vi khuẩn gây bệnh phát sáng trên tôm sú thử với loại kháng sinh cho thấy 100% dòng vi khuẩn kháng với AMP, 15% kháng với loại kháng sinh và 4% kháng với loại kháng sinh Theo Dung et al (2009) nghiên cứu 50 chủng vi khuẩn gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra thử với 17 loại kháng sinh, kết tìm thấy 86% chủng vi khuẩn kháng ít lại kháng sinh, trên 70% chủng vi khuẩn kháng từ đến loại kháng sinh theo Miranda và Zemelman (2002) có 74 chủng vi khuẩn phân lập trên cá hồi nước các trại nuôi thủy sản Chile có tượng kháng đồng thời với – 10 loại thuốc kháng sinh 28 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1   5.2 Kết luận Kết phân lập Kết kiểm tra kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn trên gan tụy tôm TCT với 12 loại kháng sinh cho thấy đa số các chủng nhạy với thuốc kháng sinh thử nghiệm.Chỉ có loại kháng sinh có độ nhạy thấp là Ampicillin(20%)Amoxicillin(30%), Cefazolin(40%) Đề xuất  Tiếp tục phân lập và định danh các chủng vi khuẩn trên gan tụy tôm TCT đồng thời gây cảm nhiễm các nhóm vi khuẩn thu để tìm hiểu độc lực nhóm vi khuẩn này  Kiểm tra thay đổi mô học trên gan tụy tôm TCT bị vi khuẩn công TÀI LIỆU THAM KHẢO Austin, B & D.A Austin 1993 Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, 2nd edn Ellis Horwood Ltd., Chichester Baumann, P A L Furnss and J V Lee 1984 Genus Vibrio pacini 1854, 411 al 518-538 pp In: Krieig, N R and J G Holt (eds) Bergeyf’s manual of systematic bacteriology, Volume1 William and Wilkin Baltimore Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học Thủy Sản Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản Bùi Quang Tề,2003 Bệnh tôm và biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông Nghiệp.200trang 29 Cao Chí Thuận, 2009 Phát white spot syndrome virus (wssv) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ (penaeus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học Châu Ngọc Sơn, 2008 Nghiên cứu biến động quần thể vi sinh vật và chất lượng nước ao nuôi tôm sú (penaus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1) Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA Cowan, Steel G.I Barrow and R.K.A Felltham 1987 Manual for the indentification of Media Bacteria 262p Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại và khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (penaeus monodon) Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ: 42-52 10 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006 Sưu tập và phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản nuôi Đồng sông Cửu Long Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ: 53-61 11 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004.Giáo trình Bệnh học thủy sản Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang 12 FAO, 2005 Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội-2005 13 FAO,2004, Introduction and movement of Penaeus vannamei and Penaeus Stylirostris in Asian and the Pacifi c, Bangkok 14 Geert Huy, 2002 Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated bacteria with the broth macrodilution method (MIC Determination), Laboratory of Microbiology, K.L Ledeganckstr 35 B9000 Gent (BELGIUM) 30 15 Http://agribank.com.vn/31/834/tin-tuc/thi-truong-nongnghiep/2011/01/3119/lan-dau tien-viet-nam-xuat-khau-tom-vuot-2tyusd.aspx 16 http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/83/93499/tom-tiep-tuc-chethang-loat.aspx, 2012 Truy cập 30/06/2012 17 http://tepbac.com/news/full/1347/Chua-ro-nguyen-nhan-hoai-tu-gantuy-cap-tren-tom-nuoc-lo.htm Truy cập 30/06/2012 18 Http://tepbac.com/news/full/1371/Mien-Trung-lai-lao-dao-vi-tom.htm, 2012 Truy cập 30/06/2012 19 Http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1708.let, Tạp chí thủy sản Việt Nam 20 Http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4m_th%E1%BA%BB_ch %C3%A2n_tr%E1%BA%AFng#Tham_kh.E1.BA.A3o Truy cập ngày 30/06/2012 21 Http://www.oie.int 22 http://www.tomgionghvb.com/tim-tuc-hvb/tom-the-chan-trang.Truy cập 30/06/2012 23 Lê Xuân Sinh, 2003 A Bio-economic Model ò a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Viet Nam Luận án tiến sỹ Kinh tế nông nghiệp- Đại Học Sydney, Australia 24 Lê Xuân Sinh,2010.Giáo trình kinh tế thủy sản.Nhà xuất Đại Học Cần Thơ 25 Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004 Kỹ thuật nuôi và sản xuất giống thủy sản nước lợ 26 Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2003 Ứng dụng kỹ thuật phân tử để phát bệnh nhiễm nuôi trồng thủy sản Trí thức Phú Yên 27 Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008 Biến động mật độ vi khuẩn ao nuôi tôm sú ( penaus monodon) Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 28 Tài liệu thực tập Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, 2011.Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản.Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 29 Thái Bá Hồ-Ngô Trọng Lư, 2003 Kỹ thuật nuôi tôm he chân trắng Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội.109 trang 31 30 Trần Ngọc Hải, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa và Nguyễn Thanh Phương, 2000 Bài giảng bệnh giáp xác 31 Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008 phát triển qui trình mPCR (multiplex polymerase chain reaction) phát wssv(white spot syndrome virus), hpv (hepatopancreatic Parvovirus)và nội chuẩn β-actin trên tôm sú (penaeus monodon) 32 Trần Thế Anh,2010 Phân tích thực trạng nuôi tôm Đồng sông Cửu Long Chuyên đề Kinh tế Nông Nghiệp.Khoa KT&QTKD.Trường Đại Học Cần Thơ 33 Trần Thị Phương Trang, 2009 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát WSSV mẫu tôm sú (Penaeus monodon).Luận văn tốt nghiệp đại học 34 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng bệnh virus trên động vật thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 35 Trần Viết Mỹ, 2009 Cẩm nang nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Tp.Hồ Chí Minh trung tâm khuyến nông khuyến ngư 36 Trần Việt Tiên, 2007 Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR chẩn đoán wssv (white spot syndrome virus) và gav (gill-associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học 37 Từ Thanh Dung, 2011 Bài giảng Bệnh vi khuẩn động vật thủy sản Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ 13 Trang 38 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình Bệnh học thủy sản Tủ sách Đại Học Cần Thơ 164 Trang 39 Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn (2009) Hiện trạng đa kháng trên vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypopththalmus đồng bằn sông cửu long Tạp chí nghiên cứu khoa học Trường Đại học Cần Thơ 40 Vlak, J.M., J.R Bonami, T.W Flegel, G.H Kou, D.V Lightner, C.F Lo, P.C Loh, and P.J Walker 2002 NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates ICTV, Paris, 2002 32 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp xác định các tiêu sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc Các chủng vi khuẩn cấy trên môi trường thạch NA+, ủ 28oC sau 24 tiến hành quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc và ghi nhận kết sau: khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, nhẵn và có màu trắng đục Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước lên lame kính, dùng que cấy nhặt ít vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khô nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lame trên lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lame Các bước thực hiện: Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I) lên lame Để phút Rửa nước cất cho hết màu tím trên lame (khoảng giây), để khô Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) lên lame, để khoảng phút Lật nghiêng lame kính cho hết dung dịch Iodine trên lame Dùng dung dịch cồn: Aceton (dung dịch III) để tẩy màu cách nghiêng lame kính nhỏ từ từ dung dịch III giọt nước cuối trên lame không còn màu tím Rửa nước cất và để khô Nhỏ dung dịch Safranin (dung dịch IV) lên lame, để khoảng phút Rửa nước cất và để khô nhiệt độ phòng Quan sát vật kính 100X có giọt dầu Đọc kết Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ Tính di động Cho giọt nước muối sinh lý trên lame, lấy ít vi khuẩn cho vào giọt nước muối sinh lý Đậy lamella lại (tránh không để xuất bọt khí) Đọc kết kính hiển vi 100X có giọt dầu Phản ứng Oxidase: Dùng dung dịch Oxidase Dùng que cấy phết ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch Oxidase Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) làm giấy lọc chuyển sang màu xanh vòng 10 giây và ngược lại 33 Phản ứng Catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3 ml H2O2 100 ml nước cất) i Dùng que cấy nhặt ít vi khuẩn để lên lame ii Nhỏ lên vi khuẩn giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch 3% H2O2 và ngược lại Khả lên men và oxy hóa đường glucose (O/F): Các bước thực hiện: Đun và cấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F Tiệt trùng 121oC 15 phút, để nguội 45oC Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3-5 ml môi trường vào ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa môi trường O/F Sau đó phủ 0,5 – ml dầu parafin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ ấm 28oC Theo dõi và đọc kết sau từ đến ngày Lên men (F) ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng Không đổi (N) hai ống có màu xanh lá cây xanh lơ Phản ứng O/129 Phản ứng dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio Vi khuẩn Aeromonas kháng (âm tính) và Vibrio (dương tính) với hợp chất này Các bước thực hiện: Nuôi tăng sinh vi khuẩn ống nghiệm Dùng pipette tiệt trùng hút vi khuẩn ống nghiệm cho giọt lên đĩa agar Dùng que trãi thủy tinh trãi vi khuẩn trên đĩa agar Đậy nắp đĩa để khoảng phút Dán các đĩa giấy tẩm O/129 nồng độ 10g và 150g lên đĩa agar Ủ tủ ấm 28 – 30oC và đọc kết sau 24 Kết quả: Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên vòng tròn vô trùng 15 mm quanh giấy tẩm O/129 Môi trường dinh dưỡng dùng để test O/129 phải có nồng độ muối thích hợp cho vi khuẩn Vibrio phát triển, thông thường sử dụng môi trường TSA NA + 1,5% NaCl 34 35