Structural characterization of animal adenovirus fibre heads

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN HỒNG THANH STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF ANIMAL ADENOVIRUS FIBRE HEADS Chuyên ngành : Hóa sinh học Mã số : 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2016 Cơng trình đƣợc thực Trung tâm cơng nghệ sinh học Hội đồng nghiên cứu Quốc gia Tây Ban Nha (CNB-CSIC, Madrid, Spain) & Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam (IBT-VAST, Hanoi, Vietnam) Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trƣơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học, IBT-VAST TS Mark Johan van Raaij Centro Nacional de Biotecnologia, CNB-CSIC Phản biện 1: PGS TS Bùi Phƣơng Thuận Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên, Hà Nội Phản biện 2: PGS TS Trƣơng Quốc Phong Trƣờng ĐH Bách khoa, Hà Nội Phản biện 3: TS Chu Nhật Huy Viện Công nghệ sinh học Luận án đƣợc bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Công nghệ sinh học Vào hồi , ngày tháng năm 2016 Có thể tìm luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Adenovirus đƣợc biết đến nhƣ vector hữu hiệu việc chuyển gen dùng liệu pháp gen Adenovirus xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua vùng gắn đặc hiệu nằm đỉnh protein sợi (fibre protein) Vùng nhận biết thụ thể nằm màng tế bào vật chủ, giúp adenovirus nhận dạng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua chế nhập bào (endocytosis) Cấu trúc protein sợi adenovirus đƣợc công bố, nhiên, hầu hết adenovirus lây nhiễm ngƣời thuộc chi Mastadenovirus Các vector có nguồn gốc adenovirus thƣờng đƣợc nghiên cứu phát triển dựa hệ gien adenovirus type lây nhiễm ngƣời (thuộc chi Mastadenovirus) Một số đƣợc nghiên cứu dựa hệ gien ovine adenovirus (Hofmann 1999; Kümin 2002; Both 2004) Tuy nhiên, hiệu sử dụng vector có nguồn gốc từ adenovirus lây nhiễm ngƣời bộc lộ hạn chế nhƣ: 1) Không vƣợt qua đƣợc hàng rào miễn dịch thể vật chủ (Daya 2008; Brunetti-Pierri 2013; Wold 2013); 2) Các vector thƣờng có xu hƣớng tập trung tế bào gan sau đƣợc đƣa vào thể vật chủ tính lực cao với coxsackie adenovirus receptor (CAR) (Douglas 2007) Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi adenovirus lây nhiễm động vật với vùng gắn đặc hiệu yếu tố quan trọng để hiểu rõ khác biệt chế xâm nhập adenovirus lây nhiễm ngƣời động vật Các nghiên cứu sở cho việc thiết kết vector chuyển gen phù hợp với mục đích điều trị bệnh hiểm nghèo liệu pháp gen Do thực đề tài: “Structural characterization of animal adenovirus fibre heads” (tên tiếng Việt: Nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật) Mục tiêu nghiên cứu Để thực đề tài này, chúng tơi xác định mục tiêu theo cơng đoạn q trình nghiên cứu từ tách dòng, biểu tinh chế protein tới tạo tinh thể, xác định cấu trúc bƣớc đầu sàng lọc thụ thể tiềm Các mục tiêu luận án gồm có: 1) Biểu tinh chế protein sợi đầu mút số loài adenovirus lây nhiễm số động vật khác nhƣ chim săn mồi (raptor adenovirus), bò (bovine adenovirus), thằn lằn (lizard adenovirus) ngỗng (goose adenovirus) 2) Tạo tinh thể protein sợi đầu mút loài adenovirus khác xác định cấu trúc phƣơng pháp phù hợp nhƣ thay phân tử (molecular replacement) phƣơng pháp single isomorphous replacement (SIR) single anomalous dispersion (SAD) 3) Xác định thụ thể tiềm có liên quan đến q trình nhận dạng xâm nhập adenovirus vào tế bào vật chủ kỹ thuật glycan-array Nội dung nghiên cứu Để thực đƣợc mục tiêu nêu trên, công việc cụ thể đƣợc tiến hành gồm có: 1) Thiết kế plasmid mang vùng gen mã hóa cho protein sợi đầu mút (fibre head) số loài adenovirus khác nhƣ raptor adenovirus, bovine adenovirus, lizard adenovirus goose adenovirus 2) Biểu protein hệ biểu E coli tinh chế protein qua hai bƣớc gồm sắc ký lực His-tag sắc ký trao đổi ion 3) Xác định độ đồng tính bền nhiệt protein sau tinh chế kỹ thuật Thermo-Fluor 4) Tạo tinh thể protein sử dụng điều kiện kết tinh khác nhằm tạo tinh thể có chất lƣợng cao dùng cho nhiễu xạ tia X 5) Giải cấu trúc tinh chỉnh cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus dạng đơn lẻ dạng gắn với chất gắn (ligand) đặc hiệu 6) So sánh khác biệt cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngƣời cho động vật nhằm tìm vị trí tƣơng tác đặc hiệu nằm vùng gắn 7) Xác định thụ thể tiềm tham gia vào trình gắn đặc hiệu với protein sợi đầu mút kỹ thuật glycan-array kỹ thuật vật lý – hóa sinh khác Ý nghĩa khoa học thực tiễn Tại thời điểm tiến hành nghiên cứu này, có 02 cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật đƣợc công bố tổng số 18 cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus ngân hàng liệu cấu trúc protein (protein data bank) Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng việc xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật Việc sử dụng vector chuyển gen có nguồn gốc từ adenovirus lây nhiễm ngƣời (chủ yếu adenovirus típ 5) cịn gặp nhiều hạn chế gặp phải hàng rào miễn dịch ngƣời tính khơng đặc hiệu tế bào đích Do đó, việc nghiên cứu sử dụng adenovirus lây nhiễm động vật làm vector chuyển gen cho ngƣời đƣợc xem nhƣ giải pháp thay đầy triển vọng Các vector sử dụng protein sợi đầu mút cho việc nhận dạng tế bào tƣơng tác với thụ thể Do vậy, nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus có tác dụng tìm chế tƣơng tác protein sợi với thụ thể, từ xác định đƣợc axit amin tham gia tƣơng tác với thụ thể Những thông tin cho phép nhà khoa học, đột biến điểm, thay đổi trình tự axit amin vùng protein sợi đầu mút nhằm định hƣớng vector gắn vào tế bào đích mong muốn Luận án xác định thành công bốn cấu trúc protein sợi đầu mút số loài adenovirus lây nhiễm động vật xác định đƣơc số polysaccharides tiềm tƣơng tác với protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngỗng Các kết có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao, góp phần vào việc bổ sung thơng tin cấu trúc cho q trình nghiên cứu phát triển hệ vector chuyển gen dùng liệu pháp gen Đóng góp luận án Luận án thành công việc xác định cấu trúc protein sợi đầu mút số adenovirus lây nhiễm động vật Cụ thể, gen mã hóa cho protein sợi đầu mút số lồi adeovirus đƣợc tách dịng biểu thành công dạng tan số chủng E coli khác Protein đƣợc tinh chế thành công qua hai bƣớc tinh chế, nhằm thu đƣợc protein có độ độ đồng cao Protein sợi đầu mút đƣợc kết tinh điều kiện khác nhau, tạo nên tinh thể có chất lƣợng cao dùng cho phân tích nhiễu xạ tia X Bốn cấu trúc protein sợi đầu mút đƣợc giải tinh chỉnh với độ phân giải cao (1.2 – 2.0 Å) Hai bốn cấu trúc đƣợc cơng bố tạp chí Virology Journal chuyên virus đƣợc lƣu trữ ngân hàng liệu cấu trúc protein (PDB) Các cấu trúc lại đƣợc đăng tạp chí chuyên ngành uy tín đƣợc bổ sung ngân hàng liệu protein Quá trình sàng lọc thụ thể tiềm kỹ thuật glycan-array cho thấy, protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngỗng (goose adenovirus fibre head) có khả gắn với số loại đƣờng xuất bề mặt tế bào ung thƣ khối u Đây kết mới, chƣa đƣợc cơng bố có giá trị mặt thực tiễn việc nghiên cứu phát triển hệ vector chuyển gen dựa adenovirus có nguồn gốc động vật Cấu trúc luận án Luận án gồm 150 trang, đƣợc chia thành phần: Mở đầu (02 trang); Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (29 trang); Chƣơng 2: Vật liệu phƣơng pháp (25 trang); Chƣơng 3: Kết nghiên cứu (57 trang); Chƣơng 4: Thảo luận (13 trang); Kết luận kiến nghị (02 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (01 trang); Tóm tắt (7 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang) Luận án có 52 hình 12 bảng số liệu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Adenovirus Adenovirus đƣợc phân lập lần Wallace Rowe vào năm 1953 từ dịch môi trƣờng nuôi cấy mơ hạch hạnh nhân (adenoid) ngƣời Adenovirus có nguồn gốc từ tên tiếng anh adenoid mang ý nghĩa vùng vòm họng đƣợc đề xuất Joseph A Bell vào năm 1956 Adenovirus thuộc họ Adenoviridae gồm chi: Mastadenovirus, Atadenovirus, Siadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, có khả xâm nhiễm vào tất lớp động vật có xƣơng sống gồm cá, lƣỡng cƣ, bò sát, chim thú Khi xâm nhiễm vào thể ngƣời, adenovirus thƣờng gây triệu chứng đƣờng hô hấp bao gồm triệu chứng nhƣ viêm màng kết, viêm amidan, viêm tai, viêm bạch hầu, viêm quản mà chủ yếu xuất đồng thời hai triệu chứng viêm màng kết viêm amidan Hình 1.1: Sơ đồ phân loại chi adenovirus thuộc họ Adenoviridae Adenovirus xâm nhập vào tế bào vật chủ khơng tích hợp vào genome tế bào vật chủ chép độc lập nhân tế bào vật chủ nhƣ thực thể bổ sung Do khơng có nguy gây hại mặt di truyền cho tế bào vật chủ Chính điều mà adenovirus đƣợc quan tâm nghiên cứu sử dụng nhƣ vector chuyển gen liệu pháp gen 1.2 Cấu trúc protein sợi adenovirus Protein sợi (fibre) dạng tam phân (trimer), đơn phân đƣợc cấu tạo gồm vùng (domain) riêng biệt: penton base binding domain: vùng trình tự đầu N protein sợi, làm nhiệm vụ gắn với penton góc hình khối capsid; protein sợi đầu mút: vùng trình tự đầu C, cấu trúc có dạng hình cầu với vị trí gắn đặc hiệu với thụ thể nằm màng tế bào đích; vùng fibre shaft: vùng liên kết hai vùng gắn penton base với protein sợi đầu mút protein sợi đầu mút phần cấu trúc quan trọng tham gia vào trình nhận biết thụ thể màng tế bào trƣớc xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua việc tƣơng tác protein sợi đầu mút với thụ thể bề mặt tế bào Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc vùng protein sợi đầu mút quan trọng Hình 1.2: Mơ hình cấu trúc adenovirus (A) Vỏ capsid đƣợc cấu tạo hình 20 mặt (icosahedra) Các protein sợi (fibre protein) gắn từ đỉnh capsid (B) Protein sợi đƣợc cấu tạo domain riêng biệt: vùng gắn với penton đầu N, vùng tƣơng tác với thụ thể đầu C vùng fibre shaft làm nhiệm vụ liên kết vùng đầu N đầu C 1.3 Ứng dụng adenovirus liệu pháp gen Adenovirus đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ vector hữu hiệu việc chuyển gen với đặc điểm trội nhƣ khơng tích hợp vào genome tế bào vật chủ, tự chép cách độc lập nhân tế bào vật chủ, khơng gây nguy hại mặt di truyền Adenovirus thuộc loại virus khơng có màng bọc với genome có chất sợi ADN kép với kích thƣớc khoảng 35 kb, 30 kb đƣợc thay đoạn ADN ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen liệu pháp gen 1.4 Tinh thể hóa protein xác định cấu trúc Kỹ thuật nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) mở hƣớng nghiên cứu đầy tiềm lĩnh vực nghiên cứu khác nhƣ sinh học cấu trúc, hóa sinh, khoa học vật liệu, y học phân tử, nghiên cứu phát triển thuốc Tinh thể hóa protein bƣớc tiên việc xác định cấu trúc kỹ thuật nhiễu xạ tia X Nguyên lý trình tinh thể hóa protein đƣợc hiểu đơn giản việc kết tủa thuận nghịch phân tử protein tồn trạng thái có nồng độ độ đồng cao Các phân tử protein dung dịch kết tinh kỹ thuật khuyếch tán khơng khí (vapour diffusion technique) nhằm đƣa nồng độ protein giếng đạt tới trạng thái bão hòa Tại trạng thái này, số điểm nucleation đƣợc hình thành protein tập trung với nồng độ cao Các phân tử protein xung quanh đƣợc xếp lắp ráp vào tinh thể theo trật tự định (space group), tạo nên tinh thể hình khối chiều với đƣờng kính khoảng vài chục tới vài trăm micromet Hình 1.3: Qui trình xác định cấu trúc phân tử protein Bắt đầu từ biểu tinh chế protein, kết tinh protein, phân tích tinh thể nhiễu xạ tia X, thu thập số liệu, xử lý số liệu, xác định tinh chỉnh cấu trúc Cấu trúc không gian phân tử protein đƣợc xác định dựa vào việc kỹ thuật nhƣ thay phân tử (molecular replacement) phân tử protein có độ tƣơng đồng cao với cấu trúc biết, kỹ thuật single isomorphous replacement (SIR) hay single anomalous dispersion (SAD) sử dụng tín hiệu khác biệt từ nhiễu xạ nguyên tử kim loại nặng Qui trình từ tinh chế protein tới kết tinh, nhiễu xạ tia X, xác định tinh chỉnh cấu trúc, phân tích cấu trúc đƣợc thể hình 1.3 1.5 Ý nghĩa việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật Cấu trúc protein sợi đầu mút đƣợc nghiên cứu rộng rãi, hầu hết thuộc adenovirus thuộc chi Mastadenovirus lây nhiễm ngƣời số động vật Tại thời điểm bắt đầu thực nghiên cứu, có 16 cấu trúc protein sợi đầu mút mastadenovirus 02 cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật đƣợc công bố ngân hàng liệu protein Do việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật cung cấp thông tin chi tiết cấu trúc số loài adenovirus lây nhiễm động vật Tạo điều kiện cho việc so sánh với cấu trúc biết nhằm vùng định lên việc tƣơng tác với thụ thể màng tế bào Việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút với vùng gắn đặc hiệu yếu tố quan trọng để hiểu rõ khác biệt chế xâm nhập adenovirus lây nhiễm động vật Nguồn liệu cấu trúc protein sợi đầu mút tiền đề cho việc nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen định hƣớng tế bào đích Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các hóa chất vật liệu dùng sinh học phân tử đƣợc sử dụng hãng uy tín giới nhƣ Sigma-Aldrich (Missouri, USA), Merck (New Jersey, USA) hay VWR (Pennsylvania, USA) Protein đƣợc tinh chế sắc ký lực kim loại sử dụng chất giá Ni-NTA hãng Jena Biosciences (Jena, Germany) Tinh chế lần hai đƣợc tiến hành sắc ký trao đổi ion sử dụng cột trao đổi ion dƣơng Resource S6 cột trao đổi ion âm Resource Q6 hãng GE-Healthcare (Madrid, Spain) Quá trình kết tinh protein sử dụng kit hãng Jena Biosciences, Sigma-Aldrich, and Molecular Dimensions (Newmarket, Suffolk, UK) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Biểu hiện, tinh chế tạo tinh thể protein sợi đầu mút số loại adenovirus Các đoạn DNA mã hóa cho protein sợi đầu mút đƣợc tách dòng plasmid pET28a(+) Protein đƣợc biểu vùng protein sợi dạng tan hệ biểu E coli, đƣợc làm qui trình tinh chế gồm hai bƣớc: tinh chế cột sắc ký lực kim loại tinh chế qua cột sắc ký trao đổi ion Protein đƣợc cô đặc tới nồng độ thích hợp từ 10-20 mg/ml cột Unicorn, Millipore Protein cô đặc đƣợc sử dụng cho trình kết tinh đĩa MRC Swissci 96 giếng nhiệt độ 21ºC sử dụng kit thƣơng mại hãng cung cấp uy tín (Sigma-Aldrich, Jena-Biosciences, Emerald BioSystems) Các tinh thể protein đƣợc thu nhận phân tích phƣơng pháp nhiễu xạ X-ray (X-ray diffraction) hệ thống phát tia X (beamline) ALBA, Barcelona, Tây Ban Nha Eurepean 12 3.1.3 Cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút raptor adenovirus, thuộc chi Siadenovirus, đƣợc xác định phƣơng pháp thay phân tử (molecular replacement) sử dụng cấu trúc protein sợi đầu mút turkey adenovirus làm cấu trúc khn Với tỉ lệ giống hệt trình tự protein sợi đầu mút raptor adenovirus turkey adenovirus 19%, việc xác định cấu trúc dựa phƣơng pháp thay phân tử khó khăn Tuy nhiên, cấu hình khơng gian cấu trúc tổng thể protein sợi đầu mút raptor turkey adenovirus giống nhau, phƣơng pháp thay phân tử đƣợc sử dụng thành công để xác định cấu trúc vùng protein sợi đầu mút raptor adenovirus Cấu trúc đƣợc xác định dạng tam phân (trimer) với tham gia liên kết phiến beta-hairpin đơn phân (monomer) với vùng HI-loop đơn phân liền kề nhƣ mơ tả hình 3.3B Đây đặc điểm chƣa đƣợc công bố cấu trúc protein sợi adenovirus Hình 3.3: Cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus (A) Cấu trúc dạng “propeller” với phiến beta-sheet kép ABCJ GHID Đầu N đầu C đƣợc đánh dấu Nt Ct Vùng beta-hairpin (axit amin 359-373) đƣợc đánh dấu dấu (*) (B) Tƣơng tác đơn phân hình thành nên tam phân (C) Bề mặt tích điện protein sợi đầu mút đƣợc dự đốn bao gồm vùng tích điện âm (đỏ) vùng tích điện dƣơng (xanh nƣớc biển) (D) Tƣơng tác bề mặt đơn phân 13 Để nghiên cứu ảnh hƣởng vùng beta-hairpin việc hình thành cấu trúc không gian dạng tam phân, đột biến đoạn đƣợc tiến hành nhằm loại bỏ vùng beta-hairpin khỏi cấu trúc protein sợi đầu mút Tuy nhiên, kết phân tích cấu trúc cho thấy, khơng có khác biệt cấu trúc protein ban đầu protein đột biến đoạn beta-hairpin (Hình 3.4) Hình 3.4: So sánh cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus dạng native (màu xanh cây) dạng đột biến đoạn beta-hairpin (màu tím) Cấu trúc đƣợc so sánh dạng đơn phân (A) tam phân (B) Đầu N đầu C protein sợi đƣợc đánh dấu Nt Ct hình A 3.1.4 Kết xác định độ bền nhiệt protein sợi đầu mút RAdV-1 Để nghiên cứu ảnh hƣởng vùng beta-hairpin việc hình thành cấu trúc không gian dạng tam phân, đột biến đoạn đƣợc tiến hành nhằm loại bỏ vùng beta-hairpin khỏi cấu trúc protein sợi đầu mút Kết xác định độ bền protein phƣơng pháp biến tính nhiệt (Thermo-Fluor) cho thấy protein đột biến đoạn beta-hairpin (đƣờng vạch đứt) có nhiệt độ nóng chảy thấp so với protein dạng native (đƣờng vạch liền) (Hình 3.5A) Trong thí nghiệm này, hai protein dạng đột biến đoạn beta-hairpin dạng native đƣợc kiểm tra độ bền nhiệt dải nhiệt độ từ 4-95ºC với tham gia chất phát huỳnh quang SYPRO-Orange Tại 95ºC, protein sợi đầu mút dạng đột biến đoạn beta-hairpin có xuất đỉnh phát huỳnh quang tƣơng ứng với thời điểm protein bị biến tính nhiệt độ 95ºC Tuy nhiên, không xuất đỉnh phát huỳnh quang 95ºC trƣờng hợp protein dạng tự nhiên 14 Hình 3.5: Nghiên cứu tính bền nhiệt protein sợi raptor adenovirus (A) Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thể tính bền nhiệt protein sợi đầu mút raptor adenovirus dạng tự nhiên (nét vạch liền) dạng đột biến đoạn beta-hairpin (nét vạch đứt) (B) Kết điện di kiểm tra gel biến tính polyacrylamide 12 % protein sợi đầu mút dạng tự nhiên (đƣờng chạy 1) protein đột biến đoạn beta-hairpin (đƣờng chạy 2) Protein biến tính dạng tự nhiên đƣợc điện di kiểm tra gel biến tính polyacrylamide Kết điện di cho thấy, protein dạng đột biến (đƣờng chạy 2, Hình 3.5B) xuất nhiều dạng oligomer so với protein dạng native (đƣờng chạy 1, Hình 3.5B) 3.2 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm bò (bovine adenovirus 4) 3.2.1 Biểu tinh chế protein sợi đầu mút bovine adenovirus Các đoạn gen mã hóa cho vùng trình protein sợi đầu mút bovine adenovirus (gồm có 248-535, 414-535 protein đầy đủ 1-535) đƣợc tách dòng vector pET28a(+) Tuy nhiên, phân đoạn 414-535 (protein sợi đầu mút) đƣợc biểu dạng tan hệ biểu E coli JM109(DE3) Protein đƣợc tinh chế qua hai bƣớc gồm sắc ký lực kim loại sắc ký trao đổi ion dƣơng Protein đƣợc đỉnh khác đƣợc ký hiệu a, b, c, d, e nhƣ hình 3.6A Kết điện di kiểm tra cho thấy, xuất băng kích thƣớc khoảng 15 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc đơn phân (Hình 3.6B) 15 Hình 3.6: Kết tinh chế protein sợi đầu mút 414-535 bovine adenovirus sắc ký trao đổi ion Protein đỉnh a, b, c, d, e đƣợc điện di kiểm tra đƣờng chạy từ 3-12 Đƣờng chạy protein tinh chế lực kim loại đƣợc imidazole pH thấp Đƣờng chạy 3-12 protein tƣơng ứng thu đƣợc đỉnh a, b, c, d e theo cặp có xử lý biến tính nhiệt (4, 6, 8, 10, 12) khơng sử lý biến tính nhiệt (3, 5, 7, 9, 11) 3.2.2 Kết tạo tinh thể protein sợi đầu mút bovine adenovirus Protein sau tinh chế đƣợc kết tinh điều kiện khác Các kit dùng để kết tinh protein đƣợc liệt kê phần vật liệu phƣơng pháp Từ 400 điều kiện kết tinh khác nhau, tinh thể có chất lƣợng cao đƣợc tìm thấy số điều kiện chứa PEG 3350 thiocyanate isothicocyanate (Hình 3.7) Hình 3.7: Tinh thể protein sợi đầu mút bovine adenovirus đƣợc kết tinh điều kiện chứa PEG 3350 thiocyanate isothiocyanate (A) Các tinh thể thu đƣợc điều kiện chứa PEG 400 glycerol (B) 16 3.2.3 Cấu trúc protein sợi vùng đầu C adenovirus lây nhiễm bò Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút bovine adenovirus thuộc chi Atadenovirus đƣợc xác định phƣơng pháp single isomorphous replacement (SIR) Trong số cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus, hai cấu trúc có nhiều đặc điểm tƣơng đồng với protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm rắn (snake adenovirus 1) chúng thuộc chi Atadenovirus Những cấu trúc đƣợc xem cấu trúc nhỏ số cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus với khoảng 120 axit amin cho đơn phân (monomer) (Hình 3.8) Hình 3.8: Cấu trúc protein sợi đầu mút của bovine adenovirus dạng đơn phân (A) dạng tam phân (C) Topology cấu protein sợi đầu mút đƣợc thể dạng phiến beta màu vàng (B) Tính tích điện bề mặt đƣợc dự đốn với vùng tích điện âm (màu đỏ) tích điện dƣơng (màu xanh) (D) Đầu N đầu C protein sợi đƣợc đánh dấu Nt Ct hình A B 3.3 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm thằn lằn 3.3.1 Biểu tinh chế protein sợi đầu mút lizard adenovirus Vùng trình tự mã hóa cho protein sợi đầu mút lizard adenovirus đƣợc xác định dựa việc phân tích trình tự cấu trúc trục trung tâm gồm đoạn lặp beta (beta spiral motif) (Hình 3.9) Các phân đoạn đƣợc dự đốn chứa vùng protein sợi đầu mút gồm có 245-433, 305-433 vùng trình tự đầy đủ tồn protein sợi 1-433 Protein đƣợc biểu hệ biểu E coli JM109(DE3) 17 Hình 3.9: Phân tích trình tự mã hóa cho protein sợi lizard adenovirus Vùng trình tự đánh dấu màu đỏ vùng trình tự 305-433 Vùng trình tự màu xanh đoạn bổ sung từ 245-305 Các plasmid mang gen mã hóa cho đoạn 245-433, 305-433 trình tự đầy đủ 1-433 đƣợc biểu E coli JM109(DE3) Protein đƣợc tinh chế qua hai bƣớc tinh chế tƣơng tự nhƣ trình tinh chế protein protein sợi đầu mút bovine adenovirus Protein đƣợc thu lại từ phân đoạn chứa nồng độ muối sodium chloride khoảng 50% Kết điện di cho thấy, protein tồn dạng đơn phân (monomer) mẫu đƣợc biến tính nhiệt 95ºC phút trƣớc đƣợc tra vào gel điện di biến tính SDSPAGE (Hình 3.10B, đƣờng chạy 4, 6, 8, 10) Dạng tam phân đƣợc tìm thấy đƣờng chạy mà mẫu khơng đƣợc xử lý biến tính nhiệt trƣớc chạy (Hình 3.10B, đƣờng chạy 5, 7, 9, 11) Hình 3.10: Kết tinh chế protein sợi đầu mút lizard adenovirus sắc ký trao đổi ion (A) Sắc ký đồ thể trình tinh chế protein sắc ký trao đổi cation (B) Điện di biến tính protein gel SDS-PAGE Đ/c 2: protein thu đƣợc từ sắc ký lực phân đoạn 250 500 mM imidazole Đ/c 3-10: protein thu đƣợc từ phân đoạn 19-22 sắc kí trao đổi ion Mẫu đƣợc xử lý biến tính nhiệt 95ºC (đ/c 3, 5, 7, 9) không xử lý nhiệt (đ/c 4, 6, 8, 10) trƣớc tra gel Protein dạng đơn phân (monomer) tam phân (trimer) đƣợc đánh dấu mũi tên đen 18 3.3.2 Kết tạo tinh thể protein sợi đầu mút lizard adenovirus Protein sợi đầu mút lizard adenovirus đƣợc kết tinh điều kiện có chứa PEG 3350 potassium thiocyanate Tuy nhiên, tinh thể protein bị phân hủy đƣợc đặt vào dung dịch có chứa Hg nhằm mục đích gắn Hg vào tinh thể protein, phục vụ cho việc thu số liệu với tín hiệu khác biệt Do vậy, protein đƣợc biểu mơi trƣờng nghèo M9 với có mặt Seleno-methionine nhằm tạo phân tử protein có chứa Seleno Protein đƣợc tinh chế kết tinh điều kiện giống với protein dạng tự nhiên (native) ban đầu 3.3.3 Mô tả cấu trúc vùng protein sợi đầu mút lizard adenovirus Cấu trúc vùng protein sợi đầu mút lizard adenovirus đƣợc xác định có nhiều đặc điểm tƣơng đồng với protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm rắn (snake adenovirus 1) chúng thuộc chi Atadenovirus Lizard adenovirus adenovirus đặc biệt với việc có hai gen mã hóa cho protein sợi hệ gen Tuy nhiên điểm đặc biệt virus có protein sợi ngắn (fibre 1) gắn vào đỉnh protein sợi dài (fibre 2) gắn vào đỉnh thông qua vùng gắn với penton base Tuy nhiên, protein sợi dài đƣợc biểu tinh chế thành công dạng tan Do vậy, cấu trúc đƣợc xác định cho protein sợi dài với nhiều điểm tƣơng đồng so với cấu trúc protein sợi đầu mút snake bovine adenovirus Hình 3.11: Cấu trúc protein sợi đầu mút lizard adenovirus dạng đơn phân (A) dạng tam phân (B) Đầu N đầu C protein sợi đầu mút đƣợc đánh dấu Nt Ct hình A 19 Cấu trúc đƣợc so sánh với cấu trúc biết gồm protein sợi đầu mút bovine adenovirus (màu hồng sẫm), snake adenovirus (màu da cam, orange) lizard adenovirus (protein sợi đầu mút sợi 1) (màu xanh cây, green) (Hình 3.12) Hình 3.12: So sánh cấu trúc protein sợi đầu mút lizard adenovirus (màu lục lam) với protein sợi đầu mút bovine adenovirus (màu hồng sẫm), snake adenovirus (màu da cam) lizard adenovirus (protein sợi đầu mút 1) (màu xanh cây) 3.4 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngỗng 3.4.1 Kết phân tích trình tự gen, xác định vùng trình tự mã hóa cho protein sợi đầu mút Tƣơng tự nhƣ protein sợi đầu mút khác, vùng trình tự mã hóa cho trục trung tâm (fibre shaft domain) protein sợi đƣợc xác định dựa vào cấu trúc lặp lại beta-spiral motif Các phân đoạn chứa vùng protein sợi đầu mút đƣợc đƣa vào vector pET28a(+) phục vụ cho mục đích biểu hệ vi khuẩn E coli Các phân đoạn gồm có 209-460, 238-460, 267-460 vùng trình tự đầy đủ 20 protein sợi 1-460 đƣợc kiểm tra biểu Tuy nhiên, vùng trình tự 238-460 đƣợc biểu dƣới dạng tan phần Protein đƣợc làm điện di kiểm tra nhƣ đƣợc mơ tả hình 3.13 Hình 3.13: Kết tinh protein sợi đầu mút goose adenovirus (A) Protein đƣợc hai đỉnh liền kề sắc ký trao đổi ion Protein đƣợc thu phân đoạn từ 22-26 (B) Kết điện di biến tính SDS với protein thu đƣợc từ phân đoạn 22-25 (đƣờng chạy 1-4, tất đƣợc xử lý nhiệt 95ºC phút trƣớc tra mẫu) Đƣờng chạy 6, protein thu đƣợc từ phân đoạn 26 (xử lý biến tính nhiệt khơng xử lý biến tính nhiệt) Đƣờng chạy M: thang protein chuẩn 3.4.2 Kết tạo tinh thể protein sợi đầu mút goose adenovirus Hơn 400 điều kiện khác đƣợc thử nhằm tạo tinh thể protein sợi đầu mút goose adenovirus Protein kết tinh số điều kiện khác dạng dài có kích thƣớc khoảng vài trăm micromet Tinh thể đạt chất lƣợng cho thí nghiệm nhiễu xạ tia X đƣợc tìm thấy điều kiện có chứa PEG 600 mơi trƣờng đệm HEPES pH 7.0 (Hình 3.14C) Hình 3.14: Kết tạo tinh thể protein sợi đầu mút goose adenovirus điều kiện khác Tinh thể đƣợc thu nhận điều kiện có chứa PEG 600 HEPES pH 7.0 (C), đủ điều kiện cho thí nghiệm nhiễu xạ tia X 21 3.4.3 Kết xác định cấu trúc protein sợi đầu mút goose adenovirus Cấu trúc protein sợi đầu mút goose adenovirus đƣợc xác định phƣơng pháp single anomalous dispersion (SAD) Cấu trúc đƣợc xác định cấu trúc lớn số cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus với 220 axit amin cho đơn phân Cấu trúc có nhiều điểm tƣơng đồng với cấu trúc protein sợi đầu mút fowl adenovirus (fibre 2) Tuy nhiên, với xuất đoạn beta ngắn vị trí song song với sợi beta A cho thấy cấu trúc có nhiều điểm tƣơng đồng với cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngƣời Hình 3.15: Cấu trúc protein sợi đầu mút goose adenovirus Dạng đơn phân (A), dạng tam phân (C) Topology protein sợi đầu mút đƣợc thể dạng phiến beta (màu vàng) (B) Bề mặt tích điện protein sợi đầu mút đƣợc dự đoán với vùng có tích điện âm (màu đỏ) vùng tích điện dƣơng (màu xanh) (D) 3.5 Kết sàng lọc thụ thể tiềm kỹ thuật glycan array Kết phân tích phổ phát huỳnh quang sử dụng micro-array chip đƣợc gắn bề mặt neoglycoconjugates glycoproteins với protein sợi đầu mút raptor adenovirus, bovine adenovirus lizard adenovirus không thu nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang từ chip Đối với protein sợi đầu mút goose adenovirus, tín hiệu huỳnh quang đƣợc thu nhận vị trí tƣơng ứng với polysaccharide Lacto-N-fucopentaose type III số đƣờng dạng Lewis-X (Hình 3.16) 22 Hình 3.16: Tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc vị trí có tƣơng tác lực protein sợi đầu mút goose adenovirus với số polysaccharides khác kỹ thuật glycan-array Protein sợi đầu mút goose adenovirus có lực cao với đƣờng Lacto-N-fucopentaose III số đƣờng dạng Lewis-X Chƣơng THẢO LUẬN Bốn cấu trúc protein sợi đầu mút (fibre head) loài adenovirus thuộc chi Atadenovirus, Aviadenovirus Siadenovirus đƣợc xác định Cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus, thuộc chi Siadenovirus, đƣợc xác định phƣơng pháp thay phân tử (molecular replacement) sử dụng cấu trúc protein sợi đầu mút turkey adenovirus làm cấu trúc khuôn Với tỉ lệ giống hệt trình tự protein sợi đầu mút raptor adenovirus turkey adenovirus 19%, việc xác định cấu trúc dựa phƣơng pháp thay phân tử khó khăn Tuy nhiên, cấu hình khơng gian cấu trúc tổng thể protein sợi đầu mút raptor turkey adenovirus giống nhau, phƣơng pháp thay phân tử đƣợc sử dụng thành công để xác định cấu trúc vùng protein sợi đầu mút raptor adenovirus Trong trƣờng hợp fibre head bovine adenovirus 4, phƣơng pháp thay phân tử đƣợc sử dụng nhƣng không thành công việc xác định đƣợc cấu trúc Do vậy, nghiên cứu sinh phải sử dụng phƣơng pháp single isomorphous replacement để xác định cấu trúc 23 fibre head bovine adenovirtus Với fibre head lizard adenovirus 2, phƣơng pháp thay phân tử không thành công, việc nhúng tinh thể với kim loại nặng (heavy atom soaking) không thành công nguyên tử kim loại nặng làm ảnh hƣởng tới cấu trúc tinh thể Do vậy, phƣơng pháp thay methionine seleno-methionine đƣợc sử dụng nhằm tạo protein có gắn Seleno Q trình đƣợc thực nhờ việc biểu protein chủng E coli B834(DE3) mơi trƣờng nghèo M9 có bổ sung selenomethionine Nhờ đó, cấu trúc đƣợc xác định thành công phƣơng pháp single anomalous dispersion (SAD) Các protein đƣợc gửi phân tích nhằm sàng lọc xác định thụ thể tiềm liên quan đến trình nhận biết xâm nhập tế bào adenovirus kỹ thuật glycan-array Tuy nhiên, protein sợi đầu mút goose adenovirus đƣợc xác định có lực với polysaccharide Lacto-Nfucopentaose Lewis-X Điều chứng tỏ polysaccharide liên quan đến q trình tƣơng tác thụ thể tham gia vào hình thành cấu trúc thụ thể tự nhiên goose adenovirus Do vậy, việc xác định cấu trúc protein sợi đầu mút goose adenovirus dạng đơn lẻ dạng tƣơng tác với loại polysaccharides cung cấp thơng tin hữu ích dùng cho việc thiết kế phát triển vector chuyển gen tƣơng lai Đối với protein sợi đầu mút raptor adenovirus 1, bovine adenovirus lizad adenovirus 2, khơng thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang có ý nghĩa thống kê vị trí tƣơng ứng polysaccharides Chứng tỏ khơng có tƣơng tác lực protein sợi đầu mút với polysaccharides gắn microarray chip Điều đƣợc giải thích cấu trúc phức tạp thụ thể tự nhiên bề mặt tế bào so với cấu trúc polysaccharides đƣợc gắn bề mặt micro-array chip Ngồi ra, q trình biến đổi sau dịch mã (rất hạn chế E coli) ảnh hƣởng tới việc tƣơng tác thụ thể với protein sợi đầu mút Do vậy, cần phải tiến hành thí nghiệm khác mức độ in vivo nhằm tìm thụ thể thực tham gia vào trình nhận biết protein sợi đầu mút, kích hoạt q trình xâm nhiễm 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã biểu tinh chế thành công protein sợi đầu mút (fibre head) tái tổ hợp dạng dung hợp với đuôi His-tag adenovirus lây nhiễm số động vật nhƣ chim săn mồi (raptor adenovirus 1), bò (bovine adenivurs 4), thằn lằn (lizard adenovirus 2) ngỗng (goose adenovirus 4) Đã tạo tinh thể xác định thành công cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus với độ phân giải cao từ 1.2 – 2.0 Å Các cấu trúc protein sợi đầu mút đƣợc xác định giữ nguyên mô hình beta-sandwich gồm ABCJ GHID liên kết vùng xoắn alpha Nhiều điểm khác biệt đƣợc so với cấu trúc biết Đã tiến hành sàng lọc thụ thể tiềm tham gia tƣơng tác với protein sợi đầu mút kỹ thuật glycan-array Protein sợi đầu mút raptor adenovirus, bovine adenovirus lizard adenovirus khơng có lực gắn với poly-saccharides micro-array chip Protein sợi đầu mút goose adenovirus đƣợc xác định có lực với Lacto-N-fucopentaose đƣờng Lewis-X, loại đƣờng đƣợc tìm thấy bề mặt tế bào khối u tế bào ung thƣ KIẾN NGHỊ Đối với protein sợi đầu mút raptor adenovirus 1, bovine adenovirus lizard adenovirus 2, cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm sàng lọc thụ thể tiềm kỹ thuật in vivo khác nhằm tìm thụ thể tham gia vào việc tƣơng tác với protein sợi Đối với protein sợi đầu mút goose adenovirus 4, cần tiến hành kiểm tra lại lực gắn với Lacto-N-fucopentaose số dạng đƣờng Lewis-X co-crystallization kỹ thuật vật lý khác nhƣ: NMR, ITC, SPR nhằm khẳng định lực gắn phân tử polysaccharides tiềm Nghiên cứu tạo đột biến điểm cấu trúc biết nhằm làm tăng lực gắn với thụ thể tiềm năng, định hƣớng thay đổi tế bào gắn đích Các adenoviruses mang cấu trúc đột biến đƣợc xây dựng phục vụ cho nghiên cứu chức sau DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Pénzes JJ, Menéndez-Conejero R, Condezo GN, Ball I, Papp T, Doszpoly A, Paradela A, Pérez-Berna AJ, López-Sanz M, Nguyen TH, van Raaij MJ, Marschang RE, Harrach B, Benkő M, San Martín C (2014) Molecular characterization of a lizard adenovirus reveals the first atadenovirus with two fiber genes, and the first adenovirus with either one short or three long fibers per penton Journal of Virology 88, 11304-11314 Nguyen TH, Vidovszky MZ, Ballmann MZ, Sanz-Gaitero M, Singh AK, Harrach B, Benkő M, van Raaij MJ (2015) Crystal structure of the fibre head domain of bovine adenovirus 4, a ruminant atadenovirus Virology Journal 2015 12, 81 Singh AK, Berbís MÁ, Ballmann MZ, Kilcoyne M, Menéndez M, Nguyen TH, Joshi L, Cañada FJ, Jiménez-Barbero J, Benkő M, Harrach B, van Raaij MJ (2015) Structure and sialyllactose binding of the carboxy-terminal head domain of the fibre from a siadenovirus, turkey adenovirus PLoS ONE 10, e0139339 Thanh H Nguyen, Mónika Z Ballmann, Huyen T Do, Hai N Truong, Mária Benkő, Balázs Harrach and Mark J van Raaij (2016) Crystal structure of raptor adenovirus fibre head and role of the beta-hairpin in siadenovirus fibre head domains Virology Journal 2016; 13: 106 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đóng góp luận án Cấu trúc luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Adenovirus 1.2 Cấu trúc protein sợi adenovirus 1.3 Ứng dụng adenovirus liệu pháp gen 1.4 Tinh thể hóa protein xác định cấu trúc 1.5 Ý nghĩa việc nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Chƣơng 10 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10 3.1 Xác định cấu trúc raptor adenovirus protein sợi đầu mút nghiên cứu ảnh hƣởng vùng beta-hairpin lên việc hình thành tam phân 10 3.2 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm bò (bovine adenovirus 4) 14 3.3 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm thằn lằn 16 3.4 Xác định cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm ngỗng 19 3.5 Kết sàng lọc thụ thể tiềm kỹ thuật glycan array 21 Chƣơng 22 THẢO LUẬN 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 KẾT LUẬN 24 KIẾN NGHỊ 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ MỤC LỤC ... nghèo liệu pháp gen Do thực đề tài: ? ?Structural characterization of animal adenovirus fibre heads? ?? (tên tiếng Việt: Nghiên cứu cấu trúc protein sợi đầu mút adenovirus lây nhiễm động vật) Mục tiêu... protein sợi đầu mút (fibre head) loài adenovirus thuộc chi Atadenovirus, Aviadenovirus Siadenovirus đƣợc xác định Cấu trúc protein sợi đầu mút raptor adenovirus, thuộc chi Siadenovirus, đƣợc xác... họng đƣợc đề xuất Joseph A Bell vào năm 1956 Adenovirus thuộc họ Adenoviridae gồm chi: Mastadenovirus, Atadenovirus, Siadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, có khả xâm nhiễm vào tất lớp động