1 Phương pháp phát vi kuẩn salmonella Có nhiều phương pháp sử dụng để phát Salmonella phương pháp ni cấy truyền thống, quan sát hình thái kính hiển vi, kiểm tra đặc tính sinh hóa, phương pháp miễn dịch (huyết học, kỹ thuật ELISA, Western blot) kỹ thuật sinh học phân tử PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR, Trong phương pháp ni cấy truyền thống, quan sát hình thái kính hiển vi, kiểm tra đặc tính sinh hóa cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay khơng có Salmonella diện mẫu, không cho phép phân biệt chủng Salmonella diện mẫu, phương pháp có nhiều trở ngại tốn thời gian phải từ – ngày, tốn công sức có độ nhạy thấp Sử dụng phương pháp miễn dịch học (dựa nguyên tắc tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể) giúp phân biệt chủng Salmonella, nhiên phương pháp gặp phải nhược điểm dễ tạo kết dương tính giả Ngồi ra, phương pháp sinh học phân tử sử dụng để phát Salmonella phương pháp PCR, mutiplex PCR, Realtime PCR, Trong đó, so với phương pháp dựa PCR cổ điển (PCR, mutiplex PCR, nested PCR) phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội có độ nhạy cao hơn, cho kết sớm không cần phải chạy điện di sau phản ứng đặc biệt phương pháp giúp định lượng xác Salmonella mẫu rút ngắn thời gian phân tích 1.1.Phương pháp PCR a Nguyên lý Nhân DNA phản ứng PCR quy trình dựa hoạt động enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích tăng theo chu kì phản ứng Một chu kì gồm bước: Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ tăng lên 94 – 96°C, làm phá vỡ liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA Giai đoạn gắn mồi: Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống nhiệt độ bắp cặp mồi, vào khoảng 45 – 60 0C, để mồi gắn vào sợi DNA đơn Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ tăng lên 72 0C, enzyme DNA polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch b Các thành phần ảnh hưởng chúng tới hiệu phản ứng PCR Khuôn DNA Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh Nhiều kỹ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có xu hướng giảm (1 µg xuống cịn 100 ng) với việc sử dụng DNA polymerase có hiệu cao Mồi Mồi (primer) chìa khóa quan trọng cho thành cơng hay thất bại thí nghiệm PCR Để đạt khuếch đại đặc trưng có hiệu cao mồi sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại phải tuân thủ theo nguyên tắc bắt cặp mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính, nồng độ mồi,… Nhiệt độ bắt cặp mồi Nhiệt độ bắt cặp mồi thích hợp nhiệt độ cho đó 1/2 số primer gắn với DNA khuôn mẫu Công thức ứng dụng trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide: Ta = (G + C) + (A + T) – 50C (Ta: nhiệt độ bắt cặp mồi) Tuy nhiên, cơng thức có tính tương đối Trên thực tế nhiệt độ bắt cặp mồi phụ thuộc vào điều kiện, thành phần phản ứng như: dung dịch đệm, Enzyme Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng từ – 2,5 đơn vị (u) cho 100 µl dung dịch phản ứng Thơng thường sử dụng 0,5 u/25 µl Nếu nồng độ Taq polymerase cao, dẫn tới sản phẩm PCR không đặc hiệu làm sai lệch kết Nếu nồng độ Taq polymerase thấp, không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo sản phẩm PCR mong muốn… Nồng độ dNTP Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphate) thường sử dụng 20 – 200 µM Nồng độ cao dễ dẫn đến khuếch đại “ ký sinh’’ Bên cạnh đó, cân thành phần dNTP ảnh hưởng đến phản ứng PCR Mất cân thành phần dNTP làm tăng lỗi chép DNA polymerase Nồng độ Mg2+ Nồng độ Mg2+ nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Mg2+ cần cho trình liên kết dNTP, cofactor cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm DNA mạch kép Nếu nồng độ Mg2+quá thấp Taq polymerase hoạt động hạn chế trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg2+ cao làm tăng tượng bắt cặp giả cho sản phẩm khơng đặc hiệu Chính phải có nồng độ tối ưu cho phản ứng Thông thường, Mg 2+ sử dụng nồng độ từ 1,5 – mM Dung dịch đệm Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu cho phản ứng PCR Nồng độ, pH dung dịch đệm nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng 1.2 Phương pháp Realtime PCR a Nguyên tắc Nguyên tắc Realtime PCR tương tự PCR truyền thống Tuy nhiên phương pháp cho phép phát định lượng tích lũy DNA khuếch đại phản ứng xảy Khả thực nhờ vào phát tín hiệu huỳnh quang chất phát huỳnh quang mồi đánh dấu huỳnh quang thêm vào PCR mix Sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với gia tăng tín hiệu huỳnh quang trình phản ứng Realtime PCR sử dụng máy luân nhiệt trang bị phận đọc tín hiệu huỳnh quang trình khuếch đại kết hiển thị nhờ sử dụng phần mềm đặc trưng máy tính Realtime PCR gồm hai trình diễn đồng thời: nhân DNA phản ứng PCR đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng DNA tạo thành Chất phát huỳnh quang thường sử dụng phản ứng Realtime PCR loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đơi DNA (ví dụ SYBR Green) mẫu dị (probe) đánh dấu huỳnh quang (ví dụ Taqman probe) b Phân tích tổng quát phản ứng Realtime PCR Trong Realtime PCR, hiển thị để người làm thí nghiệm quan sát kết phản ứng trình nhân DNA ống phản ứng biểu đồ khuếch đại Biểu đồ có trục tung (Y) cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích, cịn trục hồnh (X) chu kỳ nhiệt Đường cong khuếch đại gồm pha, pha hàm mũ (exponential phase) pha ổn định (plateau phase) Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR tăng xấp xỉ gấp đôi sau chu kỳ Tuy nhiên, phản ứng diễn ra, thành phần phản ứng bị tiêu hao, cuối phản ứng chậm lại vào pha ổn định (các chu kỳ 28 – 40) Biểu đồ khuếch đại phản ứng Realtime PCR Phân tích đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) ống phản ứng sau hoàn tất chu kỳ nhiệt, thấy thông số quan trọng ln kèm với nó, chu kì ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng hay Ct chu kì nhiệt mà thiết bị Realtime ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Để xác định cường độ huỳnh quang nền, thiết bị Realtime thường ghi nhận tín hiệu cường độ huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu, gọi chu kỳ (basal cycle), lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang gọi đường (đường ngưỡng) Chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diện khuếch đại Tùy thuộc vào số lượng DNA đích ban đầu mà có ống phản ứng có Ct sớm có ống có Ct xuất muộn Do vậy, dựa vào giá trị Ct đánh giá lượng DNA ban đầu ống phản ứng sở cho hướng định lượng phản ứng Realtime PCR c Ưu điểm Realtime PCR Ưu điểm Realtime PCR so với phương pháp PCR truyền thống cho phép xác định số lượng khn mẫu ban đầu với độ xác độ nhạy cao Kết Realtime PCR vừa kết định tính (hiện diện hay vắng mặt trình tự DNA) định lượng (số lượng DNA đích ban đầu) Thêm vào đó, kết PCR đánh khơng cần điện di gel, giúp tiết kiệm thời gian gia tăng số lượng thí nghiệm thực Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng đánh giá liệu hệ thống kín giúp làm giảm nguy ngoại nhiễm loại bỏ thao tác sau phản ứng khuếch đại d Vấn đề hạn chế Realtime PCR Ngồi ưu điểm kể phương pháp Realtime PCR gặp số hạn chế yêu cầu thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang máy tính kèm địi hỏi kỹ thao tác sử dụng máy Tuy nhiên phương pháp trước vấn đề hạn chế tương tự, phương pháp Realtime PCR phương pháp tối ưu http://www.about-salmonella.com/ http://en.wikipedia.org/wiki/Salmonella https://www.mdpi.com/23048158/8/9/371/htm#:~:text=Salmonella%20have %20been%20detected%20using,49%2C67%2C72%5D Danh mục chữ viết tắt dNTP: Deoxy Nucleotide Triphosphate DNA: deoxyribonucleic Acid PCR: phản ứng khuếch đại gen (polymerase Chain reaction) ELISA: Kỹ thuật miễn dịch lên men ... sử dụng máy Tuy nhiên phương pháp trước vấn đề hạn chế tương tự, phương pháp Realtime PCR phương pháp tối ưu http://www.about -salmonella. com/ http://en.wikipedia.org/wiki /Salmonella https://www.mdpi.com/23048158/8/9/371/htm#:~:text =Salmonella% 20have... 1.2 Phương pháp Realtime PCR a Nguyên tắc Nguyên tắc Realtime PCR tương tự PCR truyền thống Tuy nhiên phương pháp cho phép phát định lượng tích lũy DNA khuếch đại phản ứng xảy Khả thực nhờ vào phát. .. Cuối cùng, vi? ??c tiến hành phản ứng đánh giá liệu hệ thống kín giúp làm giảm nguy ngoại nhiễm loại bỏ thao tác sau phản ứng khuếch đại d Vấn đề hạn chế Realtime PCR Ngoài ưu điểm kể phương pháp Realtime