ĐẠI CƯƠNG VỀ sắc ký

Sắc Ký Cơ Sở Lý Thuyết & Đại Cương Bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM Đại học Y Dược TPHCM Sắc Ký: Đại cương Cơ sở lý thuyết Mục tiêu - Hiểu sở lý thuyết phương pháp sắc ký - Hiểu chế sắc ký - Hiểu đại lượng đặc trưng phương pháp sắc ký Dàn - Định nghóa – Quá trình sắc ký - Phân loại phương pháp sắc ký - Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký - Các chế tách phương pháp sắc ký - Các đại lượng đặc trưng phương pháp sắc ký Đại học Y Dược TPHCM Định nghóa  Qui trình chất tan tách riêng trình dịch chuyển khác động lực học chúng hai hay nhiều pha khác phân bố, hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan áp suất  Sắc ký đòi hỏi hai pha:  Pha động: chất lỏng hay dòng khí mang  Pha tónh:  Chất rắn hay chất mang trơ tẩm hay trộn chất lỏng  Tương tác với chất tan theo chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, lực  Thực tế: kết tách kết hợp nhiều chế Đại học Y Dược TPHCM SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hợp chất B Hợp chất A A B Quá trình sắc ký  Đưa hỗn hợp lên pha tónh  Khai triển sắc ký  Phát chất Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Theo chất vật lý pha  Sắc ký lỏng – lỏng  Sắc ký lỏng – rắn  Sắc ký khí – lỏng  Sắc ký khí – rắn  Theo phương tiện giữ pha tónh  Sắc ký cột  Sắc ký lớp mỏng  Sắc ký giấy  Theo chế tách  Sắc ký hấp phụ  Sắc ký phân bố  Sắc ký trao đổi ion  Sắc ký rây phân tử  Sắc ký lực Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Thông thường  Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography, CC)  Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)  Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)  Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)  Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)  Sắc ký lỏng siêu áp (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) Đại học Y Dược TPHCM Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký  Sắc ký phát triển cách logic chiết (phân chia) ngược dòng  Sắc ký chiết liên tục cân liên tục chất tan hai pha Đại học Y Dược TPHCM Sự phân chia ngược dòng (Counter Current Distribution)  Mục tiêu: tách hai hay nhiều chất tan loạt phân chia hai pha lỏng – lỏng  Chiết gián đoạn qua nhiều bước  Chiết liên tục qua nhiều bước Đại học Y Dược TPHCM Chiết gián đoạn qua nhiều bước  Giả sử có hai chất tan A B hỗn hợp AB tồn pha L (lower phase), chiết pha U (upper phase)  Ban đầu:  [A] = mM  [B] = mM  DA = [A]U/[A]L = 4, DB = [B]U/[B]L = Điều kiện cần thiết cho tách riêng hai chất phải có D hoàn toàn khác Đại học Y Dược TPHCM Chiết liên tục qua nhiều bước  Phân đoạn f (fraction) ống r sau bước chiết n: f n! pr qnr (n  r)!r!  Với n lớn, ống chứa lượng chất A cao (rmax): rmax # np Ví dụ: A có p = 4/5, sau 100 bước chiết ta có rmax # 100 x 4/5 # 80: ống 80 B có p = ½, sau 100 bước chiết ta có rmax # 100 x 1/2 # 50: ống 50 Đại học Y Dược TPHCM Độ rộng dải suất phân giải B A Phân đoạn chất tan ống (f) Phân đoạn chất tan ống (f) Tách A B phân chia ngược dòng qua 100 bước chiết B A DA = vaø DB = 7/3 DA = DB = Ống 59 - 72 Ống 81-90 Độ tinh khiết A 2,27% 38,90% 97,94% B 66,06% 0,82% 96,68% - Ống 70 - 90 hoàn toàn A - Ống 40 - 60 hoàn toàn B Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – Phân bố Chất phân tích hòa tan pha tónh lỏng bao bề mặt chất mang rắn trơ S1 (pha 1) K S2 (pha 2) [S ] K  K: hệ số phân bố [S ] - Pha (V1) có m mol chất tan S, chiết pha (V2) m q - q1 % S lại pha 1, nồng độ S pha 1: V (1  q )  m - (1-q1) % S chiết sang pha 2, nồng độ S pha 2: V Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – Phân bố (1  q )  m V K  q 2m V V q  V  KV V Tieán hành chiết lần 2: q2  V  KV   V  q   (V  KV )    Sau n lần chiết với V2, S lại pha 1: qn   V        V  KV       n q luôn nhỏ 1, sau n lần chiết tức qn vô nhỏ coi Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – Hấp phụ Chất tan hấp phụ bề mặt pha tónh SM + nMADS  SADS + nMM [S ADS ][M M ]n K [S M ][M ADS ]n SM SADS MM MADS : phân tử chất tan pha động : phân tử chất tan bị hấp phụ : phân tử pha động : phân tử pha động bị hấp phụ : bề mặt hoạt động pha tónh n: số mol pha động bị thay từ bề mặt - Pha động chạy theo chiều định nên xảy trình hấp phụ phản hấp phụ - Các chất tan bị kéo theo pha động có lực khác với pha tónh Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – Trao đổi ion Pha tónh chất trao đổi ion Gồm loại:  Nhựa trao đổi cation (cationit): Cationit acid mạnh -SO3-H+ Cationit acid yếu -COO-H+  Nhựa trao đổi anion (anionit): Anionit base mạnh -N(CH3)3+OHAnionit base yếu -NH3+OHTiến trình trao đổi: (Mx+ Ax-: Cation: xRSO3-H+ + Mx+ Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax- Điện tích cố định Ion phân tích ion chất tan) Ionit Ion trái dấu Quá trình trao đổi ion (RSO3-)xMx+ + xH+ [RN(CH3)3+]xAx-+ xOH- - Pha động thường dung dịch đệm có pH chất điện ly thích hợp - Pha động có thêm số dung môi hữu MeOH, EtOH,…để làm tăng độ hòa tan hay độ chọn lọc cho chất tan  ion chất tan cạnh tranh mạng ion Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – Rây phân tử - Ở trạng thái cân bằng: Cs  Cm Cs, Cm: nồng độ chất tan pha tónh pha động Hệ số K tính theo phương trình: Cs VR Vm K  Vm Cm Trong đó: Vm: tổng thể tích pha động nằm lỗ xốp hạt pha tónh VR: thể tích rửa giải chất tan - Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel - Dùng sinh hóa để tách protein, carbohydrat,… Đại học Y Dược TPHCM Cơ chế tách – i lực - Mới có tính chọn lọc cao - Dựa vào tương tác đặc hiệu loại phân tử chất tan với phân tử thứ hai liên kết cộng hóa trị với pha tónh Ví dụ: phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tónh kháng thể protein Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn protein qua cột, có pretein phản ứng với kháng thể giữ lại cột, protein lại rửa khỏi cột Protein bị giữ lại cột tách khỏi kháng thể cách thay đổi pH hay nồng độ ion pha động Một phân tương tác phân tử liên cộng hóa trị pha tónh tử với kết với Các phân tử khác rửa khỏi cột Sắc ký lực Đại học Y Dược TPHCM Quá trình tách sắc ký AB A t1 B Nồng độ chất tan dãi A B cột t2 Hai cách tách hai chất xen phủ Sự tách sắc ký sắc ký đồ Đại học Y Dược TPHCM Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG - SKG SKLM Vị trí vết sắc ký đồ xác định nhờ số Rf (Retardation factor) dR v Rf   d M V0 ===> Đường dung môi  Rf  - Rf = 0: chaát tan hoàn toàn không di chuyển, nằm điểm xuất phát - Rf = 1: chất tan di chuyển với vận tốc dung môi - dR: khoảng di chuyển chất cần tách - dM: khoảng di chuyển dung môi - v: vận tốc di chuyển chất cần tách - V0: vận tốc di chuyển dung môi dM dR x x Đại học Y Dược TPHCM Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG - Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf  Chất lượng hoạt tính chất hấp phụ  Chiều dày lớp mỏng, quảng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm  Vị trí số lượng chất cần tách mỏng  Thành phần độ tinh khiết pha động  Phương pháp khai triển sắc ký  Độ bão hòa dung môi bình sắc ký (hiện tượng “bờ”)  nh hưởng cấu tử khác có thành phần hỗn hợp cần tách  Độ ẩm, nhiệt độ pH Hiện tượng “bờ” Đại học Y Dược TPHCM Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG - Sử dụng chất đối chiếu OX R f ( X ) OF OX Rs ( X )    R f ( A) OA OA OF * Hai chất giống phải có Rf Rs * Hai chất phải có lượng chấm triển khai điều kiện sắc ký F X A O x x x Sắc ký đồ sắc ký đối chứng Đại học Y Dược TPHCM Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – HPLC & GC - Sắc ký khí sắc ký lỏng hiệu cao Thời gian lưu tR (phút): thời gian cần thiết để chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector cho peak sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất đỉnh peak)  tM (hoặc to): thời gian lưu chất không bị lưu giữ, gọi thời gian chết  tR lớn, chất tan bị lưu giữ mạnh tốc độ di chuyển nhỏ  Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R tính theo công thức: t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to) Đại học Y Dược TPHCM Cấu hình máy HPLC Đại học Y Dược TPHCM Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – HPLC & GC * Hai chất giống phải có tR t’R * Hai chất phải có thể tích tiêm mẫu triển khai điều kiện sắc ký Nếu trục hoành sắc ký đồ sử dụng đơn vị đo thể tích dung môi: - thể tích lưu VR - thể tích lưu hiệu chỉnh V'R - thể tích chết cột VM (thể tích rỗng Vo): thể tích dung môi từ nơi tiêm cột đến detector Đại học Y Dược TPHCM ... phương pháp sắc ký  Theo chất vật lý pha  Sắc ký lỏng – lỏng  Sắc ký lỏng – rắn  Sắc ký khí – lỏng  Sắc ký khí – rắn  Theo phương tiện giữ pha tónh  Sắc ký cột  Sắc ký lớp mỏng  Sắc ký giấy... Theo chế tách  Sắc ký hấp phụ  Sắc ký phân bố  Sắc ký trao đổi ion  Sắc ký rây phân tử  Sắc ký lực Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Thông thường  Sắc ký cột cổ điển (Column.. .Sắc Ký: Đại cương Cơ sở lý thuyết Mục tiêu - Hiểu sở lý thuyết phương pháp sắc ký - Hiểu chế sắc ký - Hiểu đại lượng đặc trưng phương pháp sắc ký Dàn - Định nghóa – Quá trình sắc ký - Phân