Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm điều chế được alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu tại vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đông máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHỊNG CHỐNG ĐƠNG MÁU TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số 9540105 : KHÁNH HÒA - 2019 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Vũ Ngọc Bội PGS TS Trần Thị Thanh Vân Phản biện 1: PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa Phản biện 2: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Hữu Đại Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi… giờ, ngày……tháng……năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang ii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Nguyễn Văn Thành Khóa: 2012 Người hướng dẫn: PGS TS Vũ Ngọc Bội PGS TS Trần Thị Thanh Vân Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án thu số kết bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất alginate alginate khối lượng phân tử thấp từ rong mơ: 1) Luận án xác định loài rong mơ S mcclurei, S polycystum T ornata có hàm lượng fucoidan cao thu hoạch vào tháng tháng Ngoài ra, loài rong nâu S mcclurei T ornata có hàm lượng alginate đạt cao thu hoạch vào tháng lồi S polycystum có hàm lượng alginate đạt cao thu hoạch vào tháng Trong số lồi rong nghiên cứu T ornata lồi thích hợp dùng làm ngun liệu cho trình sản xuất đồng thời fucoidan alginate 2) Luận án xác định điều kiện tối ưu cho q trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp 11 (điều chỉnh Na2CO3), nhiệt độ nấu chiết thích hợp 59oC thời gian nấu chiết 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết 70% Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T ornata có độ tinh cao, có tỷ lệ M/G 1,06 có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình 1037, số đa phân tán 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93% Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học vi sinh vật theo quy định hành Bộ Y tế 3) Luận án điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp phương pháp thủy phân acid Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08% Sodium guluronate sodium mannuronate thu có độ tinh cao, có khối lượng iii phân tử trung bình tương ứng 21,661 kDa 33,759 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình tương ứng 89 128, số đa phân tán tương ứng 1,38 1,49 4) Luận án xác định điều kiện thích hợp cho q trình điều chế SGS sau: điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là: tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90oC thời gian phản ứng 90 phút; điều kiện trình tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng 40oC thời gian phản ứng tổng hợp Từ đó, xây dựng quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate rong nâu T ornata Chế phẩm SGS sản xuất theo quy trình có độ tinh cao, có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình 107, số đa phân tán 1,35 5) Kết đánh giá hoạt tính chống đơng máu SGS cho thấy hoạt tính chống đơng máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình nồng độ SGS Chế phẩm SGS có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) thời gian đông máu chung (TT), tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) không đáng kể Bên cạnh đó, SGS khơng độc chuột thí nghiệm Do vậy, SGS sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu người CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS Vũ Ngọc Bội NGHIÊN CỨU SINH PGS TS Trần Thị Thanh Vân iv Nguyễn Văn Thành DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Văn Thành, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân Nguyễn Đình Thuất (2017), “Tối ưu hóa điều kiện phản ứng tổng hợp polyguluronat sulfat”, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, số 1/2017, Trường Đại học Nha Trang, trang 82-90 Nguyễn Văn Thành, Bùi Văn Nguyên, Nguyễn Đình Thuất, Trần Thị Thanh Vân Vũ Ngọc Bội (2017), “Tối ưu hóa q trình nấu chiết alginate từ bã rong nâu Turbinaria ornata (TURNER) J AGARDH”, Tạp chí Đại học Cần Thơ, 49B, Trường Đại học Cần Thơ, trang 116-121 Nguyễn Văn Thành, Đỗ Thị Thanh Xuân, Ngô Văn Quang, Vũ Ngọc Bội, Bùi Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân Thành Thị Thu Thủy (2014), “Cấu trúc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định alginate từ rong nâu Turbinaria ornata”, Tạp chí Hóa học, T.52 (6A), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, trang 149-152 Đỗ Thị Thanh Xuân, Nguyễn Văn Thành, Đặng Vũ Lương, Bùi Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân Thành Thị Thu Thủy (2014), “Nghiên cứu phân lập cấu trúc hóa học alginate phân đoạn chúng từ rong nâu Turbinaria ornata (TURNER) J AGARDH”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(5A), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, trang 35-41 v MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Luận án Alginate hợp chất hydrocolloid (dịch keo) có ứng dụng rộng rãi nhiều ngành cơng nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu giới cho thấy alginate trọng lượng phân tử thấp thể nhiều hoạt tính sinh học q hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, khả chống dị ứng, kháng khuẩn, chống béo phì, kháng ung thư, ngăn ngừa bệnh tăng huyết áp, giảm cholesteron giảm lượng đường máu, … Alginate khơng có hoạt tính chống đơng tụ máu, nhiên alginate sulfate (alginate sulfate hóa) có khả tương thích cao với máu cấu trúc tương tự cấu trúc heparin hoạt tính chống đơng máu giới nghiên cứu Alginate có hàm lượng sulfur khoảng 10 % (w/w) dùng làm chất kết dính đặc hiệu điều khiển tạo chất kháng đông kết hợp với protein Tuy nhiên, hoạt tính chống đông máu alginate sulfate phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, tỷ lệ M/G, trình tự xếp uronic, lồi rong, hàm lượng sulfur, … Chính vậy, alginate sulfate trọng lượng phân tử thấp mở tiềm ứng dụng mạnh mẽ ngành công nghiệp dược phẩm thực phẩm chức Luận án “Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu” từ nguồn ngun liệu rong mơ sau rong chiết fucoidan yêu cầu cần thiết, nhằm tăng cường khai thác sử dụng hiệu nguồn lợi rong mơ, hoàn chỉnh thêm nghiên cứu alginate rong mơ Việt Nam theo định hướng tìm kiếm, phát hoạt tính chống đơng máu Từ khơi mở nghiên cứu ứng dụng alginate khối lượng phân tử thấp vào lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ tích cực chăm sóc sức khỏe cộng đồng phát triển kinh tế xã hội tương lai Mục đích Luận án Điều chế alginate khối lượng phân tử thấp từ rong nâu thu mẫu vịnh Nha Trang, có hoạt tính chống đơng máu dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu: Alginate từ rong mơ thu vùng biển Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa 3.2 Phạm vi nghiên cứu (1) Nghiên cứu sàng lọc nguồn nguyên liệu rong nâu thích hợp dùng cho sản xuất fucoidan alginate; (2) Nghiên cứu tối ưu hóa cơng đoạn nấu chiết alginate từ rong nâu đánh giá chất lượng alginate sản xuất; (3) Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp xác định đặc tính alginate khối lượng phân tử thấp; (4) Nghiên cứu quy trình sản xuất sodium guluronate sulfate (SGS) từ alginate rong nâu T ornata đánh giá đặc tính SGS; (5) Đánh giá in vitro hoạt tính chống đơng máu đánh giá độc tính SGS dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp phân tích đại: Phân tích hàm lượng nguyên tố kim loại nặng Hg, As, Cd Pb phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - lị graphite - chất cải biến hóa học (CM-GF-AAS); Xác định khối lượng phân tử trung bình alginate phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; Xác định hàm lượng sulfate theo phương pháp sulfate bari nephtlometry (dùng ánh sáng phản chiếu để đo mật độ hạt chất lỏng); Các phương pháp xác định cấu trúc alginate: xác định phổ hồng ngoại (IR) máy FT-IR Brucker phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo nhiệt độ 70 ºC với dung môi D2O máy Brucker AVANCE 500 MHz Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Đồng thời, luận án sử dụng phương pháp toán học tối ưu hóa q trình thí nghiệm xử lý thống kê liệu thu thập nhằm đảm bảo kết thí nghiệm có độ tin cậy cao Kết cấu luận án Luận án bao gồm 148 trang, có trang mở đầu, 35 trang tổng quan, 21 trang phương pháp nghiên cứu, 87 trang kết nghiên cứu, kết luận trang, 22 bảng số liệu, 63 hình, 246 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 27 tài liệu, tiếng Anh 219 tài liệu) phụ lục 52 trang CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Trên giới tìm thấy khoảng 2.060 lồi rong nâu 95 % rong nâu có nguồn gốc biển Trong Fucales đối tượng phổ biến kinh tế rong nâu, đại diện họ Sargassaceae với hai chi Sargassum Turbinaria Trung Quốc nước có sản lượng rong nâu lớn giới với 667.000 rong khô/ năm Tiếp theo Hàn Quốc, Nhật Bản, Na Uy Chile có sản lượng rong nâu tương ứng khoảng 96.000, 51.000, 40.000 27.000 rong khô/ năm Việt Nam phát 120 loài rong nâu Mùa vụ khai thác chủ yếu từ tháng đến tháng hàng năm Sản lượng thu hoạch năm khoảng 15.000 - 35.000 rong khơ Trong đó, lồi rong nâu thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn với khoảng 68 lồi, sản lượng thu hoạch khoảng 10.000 rong khô/năm Riêng vùng biển Khánh Hịa có 39 lồi rong nâu thuộc chi Sargassum phân loại, tập trung có trữ lượng lớn vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến sản lượng ước tính 4.800 rong khơ/năm Trong thành tế bào rong nâu, thành phần anionic polysaccharide algin, fucoidin, fucin Trong đó, alginate chiếm hàm lượng cao nhất, đạt đến 40 % khối lượng rong khơ; Fucoidan chiếm hàm lượng đến 8% khối lượng rong khơ; Hàm lượng mannitol đến 30 % khối lượng rong khơ; Hàm lượng Laminaran đến 30 % khối lượng rong khô; Hàm lượng chất khoáng rong nâu cao gấp từ 10 – 20 lần so với thực vật cạn, đặc biệt giàu canxi, kali, phốtpho, magiê iod; Ngồi ra, rong nâu cịn chứa nhiều hợp chất sinh học khác sắc tố, vitamin, hợp chất phenolic, … Nhìn chung, hàm lượng thành phần hóa học rong nâu thay đổi tùy theo loài rong, mùa vụ, thời tiết, điều kiện mơi trường sống, vị trí địa lý, … Ở nước ta, rong nâu chủ yếu sử dụng cho sản xuất fucoidan thô với sản lượng vào khoảng 400 ÷ 800 fucoidan thơ năm Bên cạnh nguồn nguyên liệu bán dạng nguyên liệu thô cho Trung Quốc với giá trị kinh tế thấp dùng làm phân bón, thức ăn gia súc Rong mơ sau sử dụng cho sản xuất fucoidan, phần lại dùng làm phân bón bỏ Như vậy, thấy lãng phí nguồn tài nguyên alginate nguyên vẹn rong sau chiết rút fucoidan Do vậy, việc nghiên cứu thu nhận alginate từ rong nâu sau chiết rút fucoidan cần thiết, góp phần nâng cao giá trị cho nguồn tài ngun rong nâu Chính luận án tiếp cận theo hướng nghiên cứu thu nhận alginate từ rong nâu sau dùng rong để chiết rút fucoidan với mong muốn góp phần làm tăng hiệu khai thác sử dụng nguồn lợi rong nâu Việt Nam 1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE Alginate tên gọi chung cho muối acid alginic, anionic polysaccharide, co-polymer mạch thẳng tạo thành từ liên kết (1 4) glycosid β-D-mannuronic acid (M) α-L-guluronic acid (G) Alginate tách chiết từ rong nâu Ngồi ra, alginate cịn sản xuất từ số lồi vi khuẩn Tính chất lý học, hóa học sinh học alginate thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử, độ nhớt tỷ lệ M/G trình tự xếp uronic mạch polymer Khả hòa tan alginate phụ thuộc vào dạng tồn muối với ion kim loại, dạng muối với ion kim loại hóa trị I chúng tan nước, ngược lại với ion kim loại hóa trị II chúng khơng tan nước Công nghệ chiết tách alginate từ rong nâu nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu Các kết nghiên cứu cho thấy tùy theo loài rong nâu mà có khác chế độ xử lý rong Hiệu suất tách chiết alginate từ rong nâu phụ thuộc vào yếu tố công nghệ nhiệt độ nấu chiết, pH nấu chiết, chế độ nấu chiết ảnh hưởng đến độ nhớt alginate Độ nhớt alginate thông số quan trọng phản ánh chất lượng sodium alginate thu nhận ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận alginate Nếu độ nhớt alginate thấp tức alginate ngắn mạch Khi cấu trúc mạch alginate bị cắt ngắn trình nấu chiết hiệu suất thu hồi alginate thấp Sở dĩ có tượng alginate mạch phân tử ngắn khó bị kết tủa cồn Hiệu suất tách chiết độ nhớt alginate có liên quan mật thiết với trình nấu chiết alginate từ rong nâu Ở Việt Nam, nghiên cứu công nghệ chiết tách alginate chưa quan tâm mức khơng cịn sở Việt Nam sản xuất alginate Alginate có thị trường Việt Nam chủ yếu nhập từ nước Nghiên cứu tách chiết alginate từ bã rong nâu từ qui trình sản xuất fucoidan nghiên cứu nước thời gian từ năm 2008 – 2010 Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang Tuy nhiên, nhận thấy số điểm hạn chế sau: (1) Bã rong sau tách chiết fucoidan tiến hành phơi khơ, sau chiết tách alginate Việc làm khơ sau lại ngâm chiết dẫn đến tốn lượng, dung môi chiết rút, bã thải rong sử dụng cho việc chiết tách alginate (2) Sử dụng formol để khử màu bã rong 24 trước tách chiết alginate có nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe vệ sinh môi trường có ảnh hưởng đến độ nhớt, trọng lượng phân tử alginate (3) Sản phẩm thu alginate canxi không tan nước, để chuyển dạng natri alginate hòa tan nước phức tạp quy trình sản xuất thêm nhiều cơng đoạn (4) Quy trình sản xuất alginate chưa quan tâm đến độ nhớt alginate, chưa đánh giá chất lượng alginate chưa xác định đặc tính cấu trúc alginate 1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP Alginate khối lượng phân tử thấp điều chế nhiều phương pháp khác như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học hay phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp vật lý (phổ biến sử dụng phương pháp chiếu xạ) địi hỏi phải có thiết bị mà phịng thí nghiệm thơng thường khơng có Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân alginate thành alginate khối lượng phân tử thấp có ưu điểm không gây ô nhiễm môi trường, sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch” nên dễ tinh chế thu nhận Tuy nhiên phương pháp sử dụng enzyme mẻ Việt Nam Mặt khác chưa có chế phẩm enzyme thủy phân alginate dạng thương mại nên việc nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân alginate gặp nhiều khó khăn Phương pháp hóa học sử dụng thủy phân alginate có ưu điểm giá thành khơng cao có nhược điểm sau thủy phân cần phải tinh chế sản phẩm Tuy nhiên sử dụng phương pháp hóa học thủy phân alginate dễ thực khả thành công cao, phù hợp với điều kiện nghiên cứu nước Alginate khối lượng phân tử thấp điều chế phương pháp thủy phân hóa học (acid) nước chưa nghiên cứu nhiều, giới có nhiều nghiên cứu Việc ứng dụng alginate khối lượng phân tử thấp có liên quan tới phương pháp điều chế alginate khối lượng phân tử thấp Kết tổng quan tài liệu nghiên cứu cho thấy alginate khối lượng phân tử thấp điều chế phương pháp chiếu xạ chủ yếu ứng dụng sản xuất nơng nghiệp (cây trồng, vật ni), chưa có nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực sản xuất thực phẩm Trong đó, alginate khối lượng phân tử thấp điều chế phương pháp hóa học phương pháp sử dụng enzyme thủy phân bắt đầu nghiên cứu ứng dụng thực phẩm, mỹ phẩm y dược Chính để điều chế Hình 3.8 Phổ ESI-MS sodium Hình 3.9 Phổ ESI-MS alginate từ rong nâu T ornata disaccharide m/z 369 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR alginate từ rong T ornata Hình 3.11 Phổ 1H -NMR alginate từ rong T ornata 18 Hình 3.12 Phổ COSY alginate Hình 3.13 Phổ HSQC alginate Hình 3.14 Phổ HMBC alginate Hình 3.15 Phổ ROESY alginate 1H HOOC HO OH H H OH O OH H H HOOC H H H2 H H H5 HOOC OH HOOC HO O H H H O O HO O HOOC HO O 4H OH O OH OH G G M M G Hình 3.16 Tương tác proton phổ ROESY 19 Kết phân tích đặc tính cấu trúc sodium alginate loài rong nâu Turbinaria ornata cho thấy: cấu trúc alginate tạo thành từ hai gốc acid mannuronic acid guluronic qua liên kết (1 4) glycosid; Liên kết glycosid cacbon anomer guluronate liên kết kiểu manuronate kiểu ; Tỷ lệ M/G alginate 1,06 cho thấy thành phần alginate thành phần acid mannuronic chiếm hàm lượng nhiều so với thành phần acid guluronic; Alginate tách chiết có độ tinh cao 3.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 3.4.1 Xác định hàm lượng alginate khối lượng phân tử thấp Hàm lượng alginate (%) 60 49.17 50 40 38.13 30 20 10 3.96 SM SG SMG Phân đoạn alginate Hình 3.17 Hàm lượng alginate khối lượng phân tử thấp Kết phân tích cho thấy hàm lượng sodium guluronate (SG) thu tương đối cao, chiếm 49,17 ± 1,21 % khối lượng alginate Hàm lượng sodium mannuronate (SM) tách phân đoạn từ rong nâu T ornata thu 38,13 ± 1,16 % khối lượng alginate Hàm lượng sodium mannuronate-polyguluronate (SMG) tách phân đoạn từ rong nâu T ornata tương đối thấp, 3,96 ± 1,08 % khối lượng alginate 3.4.2 Xác định đặc tính cấu trúc alginate khối lượng phân tử thấp 3.4.2.1 Đặc tính cấu trúc sodium guluronate Kết phân tích cho thấy phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13C-NMR sodium guluronate gồm peak thể cho cacbon acid guluronic Đồng thời, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR vùng anomer peak với cường độ 20 lớn Điều chứng tỏ sodium guluronate tách với độ cao Liên kết mạch sodium guluronate liên kết kiểu α- anomer Hình 3.18 Phổ 13C-NMR sodium guluronate Hình 3.19 Phổ 1H-NMR sodium guluronate 3.4.2.2 Đặc tính cấu trúc sodium mannuronate Hình 3.20 Phổ 13C-NMR sodium mannuronate 21 Hình 3.21 Phổ 1H-NMR sodium mannuronate Kết phân tích cho thấy phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 C-NMR gồm peak thể cho cacbon acid mannuronic Đồng thời, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR vùng anomer cịn peak với cường độ lớn Điều chứng tỏ phân đoạn khối sodium mannuronate tách với độ tinh cao Liên kết mạch sodium mannuronate liên kết kiểu - anomer 3.4.3 Khối lượng phân tử trung bình alginate khối lượng phân tử thấp 3.4.3.1 Khối lượng phân tử trung bình sodium guluronate Hình 3.1 Sắc ký đồ GPC sodium guluronate Hình 3.23 Sự phân bố khối lượng phân tử sodium guluronate Kết phân tích cho thấy sodium guluronate thu từ trình thủy phân sodium alginate acid có độ tinh cao; có khối lượng phân tử trung bình ̅̅̅̅̅ Mw 21,661 ̅̅̅̅̅̅ 89; số đa phân tán PI 1,38 kDa; độ polymer hóa phân tử trung bình DPn 22 3.4.3.2 Khối lượng phân tử trung bình sodium mannuronate Hình 3.24 Sắc ký đồ GPC sodium mannuronate Hình 3.25 Sự phân bố khối lượng phân tử sodium mannuronate Kết phân tích cho thấy sodium mannuronate thu từ trình thủy phân sodium alginate acid có độ tinh cao; khối lượng phân tử trung bình ̅̅̅̅̅ Mw 33,759 kDa; độ polymer hóa phân tử trung bình ̅̅̅̅̅̅ DPn 128; số đa phân tán PI 1,499 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS 3.5.1 Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate rong nâu T ornata 3.5.1.1 Khảo sát điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa (N(SO3Na)3) 1.6 1.445f Độ thay (DS) Độ thay (DS) 1.8 1.514g 1.319e 1.4 1.2 0.984d 1.0 0.8 1.8 0.478c 0.250a 1.623d 1.6 1.719e 1.783f 1.707e 1.676g 1.409c 1.4 1.182b 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 2.0 0.742a 0.6 0.323b 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 30 40 50 60 70 80 90 15 30 45 60 75 90 105 120 Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Hình 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS Hình 3.27 Ảnh hưởng thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS 23 Độ thay (DS) 2.0 1.755f 1.8 1.6 1.609e 1.348d 1.4 1.079c 1.2 0.917b 1.0 0.8 1.673g 1.564e 0.754a 0.6 0.4 0.2 Hình 3.28 Ảnh hưởng tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay SGS 0.0 3.00/13.25/13.50/13.75/14.00/14.25/14.50/14.75/1 Tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 (mol/g) Kết phân tích cho thấy điều kiện thích hợp để tiến hành điều chế tác nhân sulfate hóa xác định sau: tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90oC thời gian phản ứng 90 phút 3.5.1.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate 1.468d 1.8 1.338e 1.4 Độ thay (DS) Độ thay (DS) 1.6 1.275f 1.2 1.0 0.856c 0.8 0.696b 0.6 0.4 1.512c 1.6 1.2 0.963b 1.0 0.8 0.708a 0.4 0.2 0.0 0.0 30 35 40 Thời gian (giờ) 2.0 1.608d 1.606d Độ thay (DS) 1.628d 1.6 1.4 1.2 0.964b 1.0 50 Hình 3.30 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay SGS 1.764c 1.8 45 Nhiệt độ (oC) Hình 3.29 Ảnh hưởng thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay SGS Độ thay (DS) 1.356e 0.6 0.314a 0.2 0.8 1.424d 1.4 0.721a 0.6 2.0 1.8 1.845d 1.6 1.4 1.243c 1.2 1.0 0.8 0.6 0.922e 0.745b 0.576a 0.4 0.2 0.4 0.2 0.0 0.0 1,0/198 1,5/198 2,0/198 2,5/198 3,0/198 3,5/198 Tỷ lệ NaNO2/SG (mol/g) 11 pH Hình 3.31 Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ NaNO2/SG đến độ thay SGS Hình 3.32 Ảnh hưởng pH phản ứng tổng hợp đến độ thay SGS 24 Kết phân tích cho thấy điều kiện thích hợp cho phản ứng tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate 2,0/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng 40oC thời gian phản ứng tổng hợp SGS 3.5.2 Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate rong nâu T ornata đánh giá đặc tính SGS 3.5.2.1 Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate rong T ornata Sodium alginate Thủy phân acid SMG SG SM Sulfate hóa Thẩm tách Cơ đặc Kết tủa Sấy chân khơng Bao gói, bảo quản Hình 3.33 Quy trình điều chế sodium guluronate sulfate từ sodium alginate * Thuyết minh quy trình: + Sodium alginate: Sodium alginate tách chiết từ rong nâu T ornata có tỷ lệ M/G = 1,06, độ ẩm 9,01%, độ nhớt 734 cP, khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình 1037, số đa phân tán 3,56 + Thủy phân acid: Sodium alginate thủy phân HCl 0,3M thời gian 30 phút 100oC bình cầu có lắp sinh hàn Làm nguội đem ly tâm (10.000 vòng/ phút, 20 phút) Phần không tan lần ly tâm tiếp tục thủy phân lần 25 dung dịch HCl 0,3M nhiệt độ 100oC Làm nguội đem ly tâm lần (10.000 vòng/phút, 20 phút) Phần dung dịch hòa tan hai lần ly tâm trung hòa NaOH 1M, thẩm tích đối nước 72 nước cất, cô đặc thiết bị cô quay chân không 50oC đến thể tích cịn lại 1/10, kết tủa ethanol 96% với thể tích ethanol gấp lần (v/v) thời gian Sau đó, ly tâm (10.000 vịng/phút, 20 phút), sấy chân khơng 50oC thu sodium mannuronate – sodium guluronate (SMG) Phần không tan lần ly tâm lần trung hịa NaOH 1M, sau dùng HCl 1M điều chỉnh pH = 2,85 ± 0,05 tiến hành ly tâm (10.000 vòng/phút, 20 phút) để tách riêng phần hỗn hợp Phần dung dịch hòa tan khơng hịa tan trung hịa NaOH 1M, thẩm tích đối nước nước cất 72 giờ, cô đặc thiết bị cô quay chân không 50 oC đến thể tích cịn lại 1/10, kết tủa ethanol 96% với thể tích ethanol gấp lần (v/v) thời gian Sau đó, ly tâm (10.000 vòng/phút, 20 phút), kết tủa sấy chân không 50oC thu sodium mannuronate (SM) sodium guluronate (SG) tương ứng + Sulfate hóa: Tác nhân sulfate hóa điều chế từ NaHSO3 NaNO2 môi trường nước với điều kiện thích hợp phản ứng sau: tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90oC thời gian phản ứng 90 phút Quá trình tổng hợp SGS tiến hành với điều kiện thích hợp là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng 40oC thời gian phản ứng tổng hợp SGS + Thẩm tách: Toàn dung dịch sau kết thúc phản ứng tổng hợp SGS tiến hành thẩm tích đối nước nước cất sau 72 để loại bỏ tất tạp chất có phần sulfate thừa + Cơ đặc: Sau kết thúc thời gian thẩm tách, dung dịch tiến hành cô đặc thiết bị cô quay chân khơng nhiệt độ 50oC đến thể tích lại 1/10 + Kết tủa: Sử dụng ethanol thực phẩm 96% với thể tích nhiều gấp lần thể tích dung dịch SGS sau đặc (v/v) Cho từ từ dung dịch SGS vào ethanol 96%, khuấy đảo để yên sau ly tâm (10.000 vòng/phút, 20 phút) thu kết tủa SGS Ethanol cần thu hồi để tái sử dụng, tránh lãng phí + Sấy chân không: Kết tủa SGS trải khay sấy có bề dày 0,5 ÷ cm, tiến hành sấy chân không nhiệt độ 50oC giờ, thu SGS khô, độ ẩm 10% + Bao gói, bảo quản: SGS bao gói polyamid, hút chân không bảo quản điều kiện thường 26 3.5.2.2 Đánh giá đặc tính sodium guluronate sulfate * Đặc tính cấu trúc sodium guluronate sulfate C-O(C-O-S) (S=O) (a) (b) Hình 3.34 Phổ FT-IR (a) sodium guluronate (b) sodium guluronate sulfate Kết phân tích phổ hồng ngoại SGS cho thấy có xuất đám phổ 1249 cm-1 875 cm-1 thể dao động biến dạng không đối xứng S=O dao động biến dạng đối xứng C-O-S kéo dài tương ứng, q trình sulfate hóa thực xảy Sodium guluronate sulfate thu có hàm lượng sulfur cao tín hiệu dao động vị trí 1249 cm-1 875 cm-1 tương đối mạnh * Khối lượng phân tử trung bình sodium guluronate sulfate Hình 3.35 Sắc ký đồ GPC sodium guluronate sulfate Hình 3.36 Sự phân bố khối lượng phân tử sodium guluronate sulfate 27 Kết phân tích cho thấy sodium guluronate sulfate thu có độ tinh cao; có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa; độ polyme hóa phân tử trung bình 107; số đa phân tán 1,35 Đánh giá độ hòa tan sản phẩm SGS sau sấy cho thấy SGS hịa tan hồn tồn nước cất 3.6 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS 3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống đơng máu SGS (in vitro) 3.6.1.1 Ảnh hưởng khối lượng phân tử trung bình SGS đến hoạt tính Thời gian (giây) chống đơng máu 200 177 155 180 155 160 140 APTT PT TT 120 100 80 45 60 35 31 40 20 28.6 28.6 28.6 15 25 35 Khối lượng phân tử trung bình (kDa) Hình 3.37 Ảnh hưởng khối lượng phân tử trung bình SGS đến thời gian đơng máu Kết phân tích cho thấy khối lượng phân tử trung bình SGS mà luận án sản xuất có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đơng máu Chế phẩm SGS thể hoạt tính chống đơng máu tốt khối lượng phân tử trung bình 25 kDa chủ yếu có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) thời gian đông máu chung (TT), nhiên có ảnh hưởng đến thời gian đông máu ngoại sinh (PT) Do luận án chọn loại SGS khối lượng phân tử trung bình 25 kDa để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống đông máu 3.6.1.2 Ảnh hưởng nồng độ SGS đến hoạt tính chống đơng máu Kết phân tích cho thấy nồng độ SGS (khối lượng phân tử trung bình 25 kDa, độ thay (DS) 1,8) có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đơng máu Hoạt tính chống đông máu SGS tăng lên nồng độ cao Tuy nhiên, nồng độ SGS có 28 tác đụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) thời gian đông máu chung (TT), khơng có tác dụng kéo dài thời gian đơng máu ngoại sinh (PT) Thời gian (giây) 180 160 170 140 153 152 APTT PT TT 120 100 80 43 41 60 30 40 20 21.5 21 22 25 50 75 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.38 Ảnh hưởng nồng độ SGS có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa đến thời gian đông máu Như vậy, từ kết phân tích cho thấy hoạt tính chống đơng máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình nồng độ SGS Hoạt tính chống đơng máu SGS tốt có khối lượng phân tử trung bình 25 kDa nồng độ SGS cao hoạt tính chống đơng máu tăng SGS có tác dụng đáng kể việc kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) thời gian đông máu chung (TT), nhiên thời gian đông máu ngoại sinh (PT) không bị ảnh hưởng khối lượng phân tử nồng độ SGS 3.6.2 Đánh giá độc tính SGS chuột thí nghiệm Gan Lách Thận Hình 3.39 Hình ảnh vi thể gan, lách, thận chuột lang uống SGS 29 Kết đánh giá độc tính với tổng liều uống 40 mg SGS/ chuột cho nhóm 1; 20 mg SGS/ chuột cho nhóm 10 mg SGS/ chuột cho nhóm chia suốt 20 ngày cho thấy SGS không gây độc cho chuột lang, thể hiện: - Toàn chuột nghiên cứu sống, khỏe mạnh, tăng trọng tốt, không khác biệt so với nhóm chứng - Chuột có khả dung nạp tốt, khơng có phản ứng bất thường xảy sau uống sản phẩm nghiên cứu suốt thời kỳ nghiên cứu - Các kết xét nghiệm huyết học, số men gan (GOT GPT) xét nghiệm 10 số sinh hóa nước tiểu cho thấy giá trị không khác biệt so với nhóm chứng - Kết giải phẫu bệnh cho thấy đại thể tất quan hoàn toàn bình thường, trọng lượng tươi gan, lách, thận (2 bên) khơng có khác biệt so với nhóm chứng Quan sát vi thể gan, lách, thận cho thấy tổn thương khác biệt chuột uống sản phẩm nghiên cứu hay uống nước muối sinh lý (nhóm chứng) Từ kết nghiên cứu độc tính chuột lang kết luận SGS an tồn khơng gây độc chuột lang sử dụng đường uống 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho thấy Luận án hoàn thành tất nội dung mục tiêu đặt Thể qua kết luận rút từ kết nghiên cứu sau: 1) Luận án xác định loài rong mơ S mcclurei, S polycystum T ornata có hàm lượng fucoidan cao thu hoạch vào tháng tháng Ngoài ra, loài rong nâu S mcclurei T ornata có hàm lượng alginate đạt cao thu hoạch vào tháng lồi S polycystum có hàm lượng alginate đạt cao thu hoạch vào tháng Trong số loài rong nghiên cứu T ornata lồi thích hợp dùng làm nguyên liệu cho trình sản xuất đồng thời fucoidan alginate 2) Luận án xác định điều kiện tối ưu cho trình nấu chiết sodium alginate có độ nhớt cao từ rong mơ T ornata: dung dịch nấu chiết có pH thích hợp 11 (điều chỉnh Na2CO3), nhiệt độ nấu chiết thích hợp 59oC thời gian nấu chiết 1,5 giờ, nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa sodium alginate từ dịch chiết 70% Sodium alginate sản xuất từ rong mơ T ornata có độ tinh cao, có tỷ lệ M/G 1,06 có khối lượng phân tử trung bình 648,32 kDal, độ polymer hóa phân tử trung bình 1037, số đa phân tán 3,56 với hiệu suất nấu chiết đạt 87,93% Sản phẩm sodium alginate sản xuất theo quy trình đạt tiêu chuẩn cảm quan, hóa học vi sinh vật theo quy định hành Bộ Y tế 3) Luận án điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp phương pháp thủy phân acid Sản phẩm sodium alginate khối lượng phân tử thấp thu bao gồm sodium guluronate chiếm 49,17 ± 1,21%, sodium mannuronate chiếm 38,13 ± 1,16% sodium guluronate - mannuronate chiếm 3,96 ± 1,08% Sodium guluronate sodium mannuronate thu có độ tinh cao, có khối lượng phân tử trung bình tương ứng 21,661 kDa 33,759 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình tương ứng 89 128, số đa phân tán tương ứng 1,38 1,49 4) Luận án xác định điều kiện thích hợp cho trình điều chế SGS sau: điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa là: tỷ lệ NaHSO 3/NaNO2 4,25/1 mol/g, nhiệt độ phản ứng 90oC thời gian phản ứng 90 phút; điều kiện trình tổng hợp SGS là: pH = 9, tỷ lệ nồng độ tác nhân sulfate hóa/sodium guluronate 2/198 mol/g, nhiệt độ phản ứng 40oC thời gian phản ứng tổng hợp Từ đó, xây dựng quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate rong nâu T ornata Chế 31 phẩm SGS sản xuất theo quy trình có độ tinh cao, có khối lượng phân tử trung bình 25,408 kDa, độ polymer hóa phân tử trung bình 107, số đa phân tán 1,35 5) Kết đánh giá hoạt tính chống đơng máu SGS cho thấy hoạt tính chống đơng máu phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình nồng độ SGS Chế phẩm SGS có tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (APTT) thời gian đông máu chung (TT), tác dụng kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) khơng đáng kể Bên cạnh đó, SGS khơng độc chuột thí nghiệm Do vậy, chế phẩm SGS hồn tồn sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu người ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Từ kết nghiên cứu luận án cho phép đề xuất sau: 1) Nghiên cứu triển khai sản xuất sodium alginate từ rong T ornata quy mô pilot để sử dụng làm nguyên liệu cho trình sản xuất SGS 2) Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất SGS để tiến tới sản xuất SGS quy mô lớn dùng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức hỗ trợ điều trị chống đông máu người 3) Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống đơng máu SGS điều kiện in vivo; đánh giá khả hấp thụ SGS từ đường uống vào máu 4) Tiếp tục nghiên cứu sulfate hóa phân đoạn mannuronate phân đoạn luân hợp mannuronate - guluronate để mở rộng hoạt tính ứng dụng hợp chất sinh học 32 ... ii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu Chuyên ngành: Công nghệ Chế. .. ngành công nghiệp dược phẩm thực phẩm chức Luận án ? ?Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức hỗ trợ phịng chống đơng máu? ?? từ nguồn ngun liệu rong mơ sau rong... nhớt alginate, chưa đánh giá chất lượng alginate chưa xác định đặc tính cấu trúc alginate 1.3 ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP Alginate khối lượng phân tử thấp điều chế nhiều phương pháp