Phát hiện gen chín chậm và gen kháng bệnh virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử trong tập đoàn công tác các mẫu giống cà chua nhập nội

Cây cà chua là loại rau ăn quả có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao. Để tạo ra giống cà chua có đặc tính chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá chúng tôi đã tiến hành sử dụng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện khả năng mang gen kháng virus và gen chín chậm của tập đoàn giống cà chua nhập nội. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc tạo ra nguồn vật liệu cho quá trình chọn tạo giống cà chua có chất lượng cao.

TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 + Đối với cá : Mƣ́c giảm lƣợng tiêu tốn thƣ́c ăn là rất lớn ( Ở mơ hình cần bổ xung 0,3-0,4 kg TĂ/kg cá so với hì nh thƣ́c nôi khác là 2,1-23 kg TĂ/kg cá ) Giảm tới 1,7 đến 1,9kg TĂ/kg cá Chi phí thƣc ăn là chi phí chủ yếu ni cá + Ngồi sàn xuất lúa , ni vị t và nuôi cá mô hì nh còn giảm đáng kể nhân công (chi phí lao động) - Giảm đáng kể lƣợng sử dụng hó a chất, phân bón sử dụng đới với mợt đơn vị diện tích canh tác lúa so với ĐC Chính sản phẩm nơng nghiệp mơ hình tạo ( ) đảm bảo an toàn vệ sinh - Hiệu quả kinh tế của MH lớn rất nhiều so với đơn canh : + Doanh thu một canh tác là rất lớn Tại Hà Yên mô hình Đạt 161,955 trđờng so với đới chƣ́ng laf56,156tr đờng tăng 106,799 tr Tại Quảng Định 181283 so với 61,369 tr tăng 119,914 tr đồng + Lợi nhuận ( lải ) Hà Yên MH đạt 58,205 tr đồng so với 11,708 tr đối chƣ́ng , gấp 4,81 lần Tại Quảng Định 76,533 tr so với 16,981 tr đồng , gấp 4,51 lần Kiến nghị : - Mô hì nh canh tác sinh thái tổng hợp lúa – cá – vịt đƣợc xây dựng , canh tác xã Hà Yên huyện Hà Trung xã Quảng Định huyện Quảng Xƣơng cần đƣợc quảng bá rộng rãi ứng dụng cho vùng có điều kiện tƣơng tự , hoặc vùng canh tác lúa nƣớc có điều kiện chủ đợng tƣới tiêu - Ngồi đối tƣợng Lúa , Cá , Vịt đề nghị nghiên cứu thêm đối tƣợng bố trí canh tác bờ bao Nhằm tận dụng tốt không gian bờ bao Cụ thể trồng có tán thấp vƣ̀a tạo bóng mát cho vị t , cá nhƣng không làm cớm rợp lúa ( đề nghị trồng Chanh , Cam , Đu Đủ ) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] Ái, Đ.N., Quy trình kỹ thuật canh tác lúa vịt vụ Đông Xuân 2004, Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Thừa Thiên Huế Viện nghiên cƣ́u TW I, Tuyển tập các công trì nh nghiên cƣ́u, 1995, NXB NN Trần Văn Vỹ, Thƣ́c ăn nuôi vị t xuất khẩu, 1995, NXBNN Lê Xuân Đồng, Kỹ thuật nuôi vịt xuất khẩu, 1994, NXBNN Lê Xuân Đồng, Nguyễn thƣợng Trƣ̀, Kỹ thuật nuôi vịt con, 1988, NXBNN Tổ chƣ́c lƣơng thƣ̣c v nông nghiệp , Nuôi vị t bộ sách hƣớng dẫn gia đì nh , 1990, Liên Hiệp Q́c PHÁT HIỆN GEN CHÍN CHẬM VÀ GEN KHÁNG BỆNH VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG TẬP ĐỒN CƠNG TÁC CÁC MẪU GIỐNG CÀ CHUA NHẬP NỘI 141 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 Nguyễn Thị Vân1 TÓM TẮT: Cây cà chua loại rau ăn có giá trị kinh tế dinh dưỡng cao Để tạo giống cà chua có đặc tính chín chậm kháng virus xoăn vàng tiến hành sử dụng kỹ thuật PCR nhằm phát khả mang gen kháng virus gen chín chậm tập đoàn giống cà chua nhập nội Điều có ý nghĩa quan trọng việc tạo nguồn vật liệu cho trình chọn tạo giống cà chua có chất lượng cao Từ khóa: cà chua chín chậm, gen kháng virus xoăn vàng ĐẶT VẤN ĐỀ: Cây cà chua (Licopersicum esculentum Mill) loại rau ăn có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc trồng với diện tích lớn rau Sản xuất cà chua miền Bắc nƣớc ta chủ yếu vụ đơng xn có nhiều yếu tố mơi trƣờng thuận lợi cho cà chua sinh trƣởng, phát triển bị sâu bệnh phá hại nên suất chất lƣợng cao Tuy nhiên thu hoạch tập trung nên giá tƣơng đối thấp ảnh hƣởng đến thu nhập ngƣời sản xuất Trong đó, từ tháng – khơng có đủ cà chua cung cấp cho thị trƣờng Vì thế, có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà chua nhƣng giống chọn tạo ta chƣa có giống có đặc tính chín chậm Hiện nhờ công nghệ gen nhiều nƣớc giới tạo đƣợc nhiều giống cà chua có tính chín chậm khơng chín Những giống có đặc tính dù đạt đủ kích thƣớc tích luỹ đủ chất khơ nhƣng khơng chín khả sinh tổng hợp ethylene Tính chín chậm (xanh) khơng chín gen Gr Nr tƣơng ứng quy định, điều khiển trình hình thành ethylene cà chua, ngƣời ta tìm thấy số thị phân tử DNA phát chọn lọc gen chín chậm Mặt khác sản xuất cà chua miền bắc nhƣ nhiều nơi giới gặp phải phá hại nặng virus, đặc biệt vụ sớm, muộn trái vụ Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống cà chua kháng virus đƣợc coi hƣớng hiệu để phòng chống bệnh Chính vậy, chọn tạo giống cà chua có khả kháng virus cần thiết Hiện nay, có gen kháng virus đƣợc phát Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 Ty-5 Các thị phân tử DNA dựa PCR phát gen Ty-1 (marker JB-1), Ty-2 (T0302) Ty-3 (P6-25) đƣợc phát triển sử dụng rộng rãi (Pena cộng sự, 2010)[2] Điều có ý nghĩa quan trọng việc phát gen kháng virus chọn tạo giống cà chua có tính kháng bệnh Để tạo giống cà chua có đặc tính chín chậm kháng virus xoăn vàng tiến hành khảo sát khả mang gen kháng virus gen chín chậm tập đoàn giống cà chua nhập nội Khoa Nông Lâm Ngư nghiệp – ĐH Hồng Đức 142 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.1 Vật liệu: Vật liệu : 45 mẫu giống cà chua nhập nội từ Pháp, Mỹ, Nhật Nga 2.2 Phương pháp nghiên cứu: a Tách chiết DNA cà chua DNA đƣợc chiết xuất theo phƣơng pháp CTAB (Doyle Doyle, 1990) b Chạy PCR phát gen chín chậm rin  Thành phần phản ứng PCR: 25µl phản ứng bao gồm µl 5X buffer; µl MgCl 3mM; 0,2 µldNTPs mix 25mM; 1,25 µl F primer 0,5 µM; 1,25 µl R primer 0,5 µM; 0,1 µl Taqpolymerase 0,5 unit; µl Template DNA; thêm nƣớc cất đến 25 µl  Trình tự cặp mồi (Zhang cộng sự, 2010)[5] F: 5’TTAAGTTGCGAAGAACTTGTTACCTT3’ R : 5’GCCAAAACACTTCAATTTCCTTTAAAATT3’  Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: 94°C phút; 35 chu kỳ: 94°C 30 giây, 53°C phút, 72°C phút kết thúc 72°C 10 phút c Chạy PCR phát gen kháng bệnh virus xoăn vàng Các thị sử dụng nghiên cứu đƣợc trình bày bảng 1: Bảng Các thị phân tử DNA sử dụng để phát gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng virus xoăn vàng Gen Sản phẩm Tài liệu liên kết PCR (bp) tham khảo S: 400bp (Pérez de F: 5’AACCATTATCCGGTTCACTC3’ JB-1 Ty-1 R: 450bp Castro, R: 5’TTTCCATTCCTTGTTTCTCTG3’ 2007)[4] F: 5’TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC3’ S: 450bp (Garcia, T0302 Ty-2 R: 5’TGATGTGATGTTCTCATCTCTAGCCTG3’ R: 600bp 2007)[3] F: 5’GGT AGT GGA AAT GAT GCT GCT C3’ S: 320bp (Ji cs, P6-25 R: 5’GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC3’ Ty-3 R:450,63 2007)[1] 0, 660bp Chú thích: “S”: alen mẫn cảm; “R”: alen kháng - Thành phần phản ứng: thể tích phản ứng 20µl gồm: µl Taq Buffer 10X; 1.5µl MgCl2 25mM; µl mồi 10µM; 0.16 µl dNTPs mix 10mM; 0.1µl(0.5U) Taqpolymerase; 15.3 µl H2O µl DNA - Chu trình nhiệt: + Mồi JB-1: 940C : phút; 20 chu kỳ (940C:10s, 550C:30s, 720:70s) 10 chu kỳ (940C: 10s, 530C: 30s , 720C: 70 s); 720C: 10 phút TT Marker Trình tự mồi 143 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 + Mồi T0302: 940C : phút; 35 chu kỳ (940C:30s, 530C: 90s, 720: 90s) 720C: 10 phút + Mồi P6-25: 940C : phút; 35 chu kỳ (940C:30s, 54.50C: 60s, 720: 60s) 720C: 10 phút Riêng sản phẩm PCR JB-1 đƣợc cắt enzyme giới hạn Taq I, lấy 10µl sản phẩm PCR ủ với U Taq I đệm đƣợc cung cấp nhà sản xuất 65 0C để qua đêm d Điện di, nhuộm kiểm tra sản phẩm gel agarose Các mảnh khuếch đại PCR sau đƣợc phân tách điện di gel agarose 2% đệm TAE X, nhuộm với ethidium bromide hiển thị dƣới ánh sáng UV 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý phần mềm Excel 2007 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: 3.1 Kết PCR phát gen chín chậm rin Trong nghiên cứu này, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc thù phát gen chín chậm rin đƣợc phát triển Zhang Xiaoli cộng (2010)[5] Cặp mồi phát đƣợc mẫu giống mang gen rin nhƣng không phân biệt đƣợc trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử [5] Kết PCR trình bày hình cho thấy mẫu giống 168, 167, R7 có vạch băng với kích thƣớc 850 bp Kích thƣớc vạch băng PCR với mô tả Zhang cộng [5] Nhƣ vậy, nghiên cứu phát đƣợc mẫu giống mang gen chín chậm rin 167, 168 R7 Mặt khác, đối chứng âm khơng có vạch băng nhân lên chúng tỏ phản ứng PCR không bị ảnh hƣởng thành phần nồng độ hóa chất tham gia Các mẫu giống 152, 163 có biểu tính chín chậm nhƣng khơng mang gen rin, mẫu giống mang gen khác quy định chín chậm nhƣ Nr hay nor 144 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm chạy PCR phát gen chín chậm rin Giếng - đối chứng âm (nƣớc cất), giếng - đối chứng dƣơng (mẫu 159 mang gen rin), giếng 3- R1, giếng 4- mẫu R2, giếng 5- mẫu R3, giếng 6- mẫu R4, giếng 7- mẫu R5, 8mẫu R6, giếng 9- mẫu R7, giếng 10- mẫu 152, giếng 11- mẫu 153, giếng 12- mẫu 168, giếng 13- mẫu 160, giếng 14- mẫu 164, giếng 15- mẫu 167, giếng 16 - mẫu H13, giếng17mẫu H14 3.2 Đánh giá đặc tính chín chậm mẫu cà chua mang gen rin: Trong nghiên cứu này, mẫu giống 167, 168 R7 mang gen chín chậm rin đƣợc đánh giá đặc tính chín chậm so sánh với đặc tính chín chậm mẫu giống khơng mang gen chín chậm R1, R4 153 Đặc tính chín chậm đƣợc đánh giá điều kiện để chín tự nhiên điều kiện thu hoạch đạt kích thƣớc tối đa, đặt nhà để chín Nhóm Mang gen rin Không mang gen rin MG 167 Bảng Đánh giá đặc tính chín chậm giống cà chua mang gen rin Trên Trong nhà Thời gian từ đạt Thời gian Thời gian từ đạt Thời gian kích thƣớc tối đa đến tồn trữ kích thƣớc tối đa đến tồn trữ quả chín (ngày) (ngày) chín (ngày) (ngày) 14,5 52,5 13,8 40,6 168 R7 16,8 13,5 50,0 40,0 12,5 9,7 45,2 45,0 R1 5,5 13,6 5,0 13,2 R4 6,7 23,0 7,2 15,3 153 5,9 11,4 5,2 10,0 145 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 Kết đánh giá đặc tính chín chậm trình bày bảng 4.8 cho thấy mẫu giống mang gen chín chậm rin thể thời gian từ đạt kích thƣớc tối đa đến chuyển màu thời gian tồn trữ dài mẫu giống không mang gen rin Thời gian từ đạt kích thƣớc tối đa đến chuyển màu điều kiện để chín tự nhiên dao động từ 13.5 đến 16.8 ngày, dài mẫu giống 168, sau 167 Các mẫu giống khơng mang gen rin thời gian ngắn hơn, dao động từ 5.5 đến 6.7 ngày, dài mẫu giống R4, 153 R1 Thời gian tồn trữ điều kiện để chín tự nhiên nhóm mang gen rin dao động từ 40.5 đến 52.5 ngày, dài mẫu giống 167, sau 168 Ở nhóm khơng mang gen rin thời gian ngắn nhiều, dao động từ 11.4 đến 23 ngày, dài R4, tiếp R1 153 Ở điều kiện thu hái, bảo quản nhà thời gian mẫu giống mang gen rin không mang gen rin ngắn so với điều kiện để chín tự nhiên Thời gian từ đạt kích thƣớc tối đa đến chuyển màu giống mang gen rin dao động từ 12.5 ngày đến 13.8 ngày, dài 167 sau 168; với giống không mang gen rin thời gian từ 5.0 đến 7.2 ngày Thời gian tồn trữ điều kiện thu hái bảo quản phịng hai nhóm nhìn chung ngắn so với điều kiện để chín tự nhiên cây, nhóm mang gen rin dao động từ 40.6 đến 45.2 ngày, dài 168, sau R7; nhóm khơng mang gen rin dao động từ 10 đến 15.3 ngày, dài R4, tiếp đến R1 153 3.3 Kết PCR phát gen kháng virus xoăn vàng 3.3.1 Kết PCR phát gen Ty-1 Theo Castro cộng (2007)[4], sản phẩm PCR thu đƣợc với marker JB-1 có vạch băng 900 bp Sau ủ sản phẩm với TaqI, mẫu mang kiểu gen ty-1/ty-1 xuất vạch băng khoảng 400 bp, có gen Ty-1 kháng virus xoăn vàng xuất vạch 450 bp vạch 500 bp Chúng sử dụng cặp mồi để phát gen kháng Ty-1 27 mẫu giống cà chua A Sản phẩm PCR với marker JB-1 B Sản phẩm PCR sau cắt enzymTaqI Hình 3.3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 146 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 Kết điện di sản phẩm PCR cắt enzyme Taq I cho thấy hầu hết mẫu giống có vạch band có kích thƣớc 400bp Riêng mẫu giống 190 có vạch băng kích thƣớc 450bp vạch band kích thƣớc 500bp nhƣ mô tả Castro cộng (2007) Nhƣ vậy, mẫu giống kiểm tra giống 190 mang gen kháng Ty-1 3.3.2 Kết PCR phát gen Ty-2 Theo Garcia (2007) cặp mồi PCR T0302F/TY-2R1 cho đoạn có kích thƣớc 600bp tƣơng ứng với locus kháng Ty-2 đoạn có kích thƣớc 450bp tƣơng ứng với locus mẫn cảm Ty-2 Chúng sử dụng cặp mồi để phát gen Ty-2 hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy mẫu giống có vạch band kích thƣớc khoảng 450bp Nhƣ vậy, theo nhƣ mơ tả kết luận mẫu giống nghiên cứu khơng có mẫu giống mang gen Ty-2 Hình 3.3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát gen Ty-2 cặp mồi T0302F/TY-2R1 Giếng 1: Kb DNA Ladder; giếng 2: 7; giếng 3: 18; giếng 4: 25; giếng 5: 30; Giếng 6: 44; giếng 7: 45; giếng 8: 64; giếng 9: 69; giếng 10: 72; giếng 11: 84;Giếng 12: 91; giếng 13: 99; giếng 14: 101; giếng 15: 189; Giếng 16: 190 3.3.3 Kết PCR phát gen Ty-3 Chúng tiến hành điện di sản phẩm PCR từ cặp mồi 27 mẫu giống kiểm tra thấy hầu hết giống có vạch băng alen mẫn cảm ty-3 (320bp) Riêng mẫu giống 189 có thêm vạch kích thƣớc 660bp mẫu giống 190 có thêm vạch 630bp Kết trùng khớp với mô tả Ji cộng (2007)[1] Nhƣ vậy, mẫu giống 189 có gen Ty-3b dạng dị hợp tử (Ty-3b/ty-3) mẫu giống 190 có gen Ty-3a dạng dị hợp tử (Ty-3a/ty-3) So sánh với kết đánh giá khả kháng bệnh mẫu giống phƣơng pháp ghép lây nhiễm cho thấy mẫu giống có khả kháng với TYLCV 147 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 Hình 3.3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát gen kháng Ty-3 Giếng 1: Kb DNA Ladder; giếng 2: 190; giếng 3: 189; giếng 4: 140; giếng 5: 138; giếng 6: 109; giếng 7: 108; giếng 8: 105; giếng 9: 104; giếng 10: 10 KẾT LUẬN: - Kết PCR phát gen chín chậm phát đƣợc mẫu giống mang gen chín chậm rin 167, 168 R7 Đánh giá đặc tính chín chậm mẫu giống cho thấy thời gian từ đạt kích thƣớc tối đa đến chín hồn tồn thời gian tồn trữ dài nhiều so với mẫu giống khơng mang gen chín chậm rin - Kết PCR với cặp mồi phát gen kháng virus xoăn vàng phát đƣợc mẫu giống mang gen Ty-1 190 mẫu giống mang gen Ty-3 189 190 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Ji, Y cộng (2007c) "Co-dominant SCAR Markers for Detection of the Ty-3 and Ty-3a Loci from Solanum chilense at 25 cM of Chromosome of Tomato" Report of the Tomato Genetics Cooperative 57: 25-28 Pena, R C D l cộng (2010) Integrated Approaches to Manage Tomato Yellow Leaf Curl Viruses "Biocatalysis and biomolecular engineering" C T Hou and J.-F Shaw, Wiley Garcia, B.E., Graham, E., Jensen, K.S., Hanson, P., Luis Mejía, L., Maxwell, D.P (2007) Codominant SCAR marker for detection of the begomovirus-resistance Ty-2 locus derived from Solanum habrochaites in tomato germplasm Tomato Genetics Cooperative Repost 57: 21-24 Pérez de Castro, A., Blanca, J.M., Díez, M.J., and Viđals, F.N (2007) Identification 148 TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 18 2014 of a CAPS marker tightly linked to the Tomato yellow leaf curl disease resistance gene Ty-1 in tomato Eur J Plant Pathol 117:347-356 Zhang Xiaoli (2010) The development of longer shelf-life gen marker and assisted selection of tomato inbredlines Huazhong Agricultural University, 46 “USING PCR TECHNIQUES TO DETECT THE IMPORTED TOMATOS THAT HAVE RESIST VIRUS AND GENES DELAY RIPENING PROCESS” Nguyen Thi Van Tomato is one kind of fruits, which has high economic and nutrient values To create tomato varieties with characteristics include delayed ripening and resistance to yellow leaf curly virus, we have conducted using PCR techniques to detect the imported tomatoes that have genes resist virus and genes delay ripening process This is very important in creation of material sources for selection of high quality tomato breeding Keywords: tomato, delayed ripening gene, tomato yellow leaf curl disease resistance gene 149 ... tạo giống cà chua có tính kháng bệnh Để tạo giống cà chua có đặc tính chín chậm kháng virus xoăn vàng tiến hành khảo sát khả mang gen kháng virus gen chín chậm tập đồn giống cà chua nhập nội. .. c Chạy PCR phát gen kháng bệnh virus xoăn vàng Các thị sử dụng nghiên cứu đƣợc trình bày bảng 1: Bảng Các thị phân tử DNA sử dụng để phát gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng virus xoăn vàng Gen Sản phẩm... mang gen kháng virus gen chín chậm tập đồn giống cà chua nhập nội Điều có ý nghĩa quan trọng việc tạo nguồn vật liệu cho q trình chọn tạo giống cà chua có chất lượng cao Từ khóa: cà chua chín chậm,