Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định được mức độ thấm nhiễm của một số dung môi hữu cơ ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp. Xác định được ảnh hưởng của một số loại dung môi hữu cơ lên biểu hiện gen cytochrom P450.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -*** - NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI HỮU CƠ ĐẾN CYTOCHROM P450 Ở NGƢỜI LAO ĐỘNG CĨ TIẾP XÚC NGHỀ NGHIỆP Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Viện Khoa học An toàn Vệ sinh lao động Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc … chấm luận án tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Dung mơi hữu hỗn hợp hóa học phức tạp có chứa nhiều loại hydrocarbon kích thƣớc nhỏ, bay vào mơi trƣờng khơng khí tạo thành hợp chất hữu dễ bay (Volatile organic compounds VOCs) VOCs nói chung, số chất nhƣ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (nhóm BTEX) nói riêng với đặc điểm khả hòa tan độ bay cao, đƣợc sử dụng sản xuất nhựa tổng hợp, sản xuất sơn, keo dán Đặc biệt, ngành sản xuất sơn việc sử dụng dung mơi hữu nhóm BTEX phổ biến Nhóm chất gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời lao động nhƣ giảm sức nghe, gây bệnh điếc nghề nghiệp, giảm chức hô hấp, số bệnh da,… Đặc biệt benzen, toluen chất gây ung thƣ Mặc dù benzen đƣợc hạn chế sử dụng thay nhóm toluen, ethylbenzen, xylen (TEX) có độ độc thấp ngành cơng nghiệp có sử dụng dung mơi hữu nói chung Đặc biệt ngành sản xuất sơn nguồn nguyên liệu ngành nhóm TEX cịn lƣợng benzen định Chính ngƣời lao động ngành sơn thƣờng xuyên phải tiếp xúc nhóm BTEX Những chất thấm nhiễm vào thể gây ảnh hƣởng đến biểu gen mã hóa cho cytochrome P450 2E1 gen CYP2E1 Gen CYP2E1 mã hoá cho enzym tham gia vào q trình chuyển hóa VOCs, styren, vinyl chloride monomer nhiều chất độc khác bao gồm tiền chất gây ung thƣ Mối liên quan phơi nhiễm BTEX môi trƣờng mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm Mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 ngƣời lao động làm việc môi trƣờng có VOCs đƣợc coi dấu sinh học để giám sát ngƣời lao động có tiếp xúc với dung môi hữu Nhiễm độc benzen đồng đẳng benzen (nhóm BTEX) đƣợc Việt Nam cơng nhận bệnh nghề nghiệp Giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với dung môi đƣợc xác định, nhƣng số giám sát sinh học đƣợc sử dụng cho dung mơi riêng rẽ, ngƣời lao động tiếp xúc với dung môi hữu thƣờng nhóm chất Ở Việt Nam, số lƣợng ngƣời lao động thƣờng xuyên phải tiếp xúc với BTEX ngành nhƣ da giày, điện tử, in cao, đặc biệt cao ngành sản xuất sơn, nhiên việc nghiên cứu số giám sát sinh học cho ngƣời lao động tiếp xúc với nhóm chất nhƣ BTEX chƣa đƣợc quan tâm Nghiên cứu ảnh hƣởng dung mơi hữu đến ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp có nhƣng chƣa nhiều, chƣa sâu, đa phần nghiên cứu dừng lại việc khảo sát nhƣ: nồng độ ô nhiễm, trạng sức khỏe công nhân Để nghiên cứu sâu ảnh hƣởng dung mơi hữu nói chung ảnh hƣởng BTEX nói riêng đến ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp, đặc biệt mong muốn tìm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với BTEX chúng tơi thực nghiên cứu : “Nghiên cứu ảnh hƣởng số dung môi hữu đến Cytochrom P450 ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp” Mục tiêu luận án - Xác định đƣợc mức độ thấm nhiễm số dung môi hữu ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp - Xác định đƣợc ảnh hƣởng số loại dung môi hữu lên biểu gen cytochrom P450 Nội dung nghiên cứu luận án - Xác định mức độ thấm nhiễm số dung môi hữu (benzen, toluen, ethylbenzen, xylen styren) ngƣời lao động sở nghiên cứu: + Xác định nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen styren môi trƣờng lao động đối tƣợng nghiên cứu + Xác định nồng độ axit t,t muconic (TTMA), O-cresol, methylhipuric (mHA), axit mandelic (MA) axit phenylglyoxylic (PGA) nƣớc tiểu TTMA, O – cresol, MA+PGA mHA lần lƣợt sản phẩm chuyển hóa benzen, toluen, ethylbenzen xylen + Xác định nồng độ dung môi nghiên cứu máu, nƣớc tiểu đối tƣợng nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng dung môi nghiên cứu đến biểu gen CYP2E1 qua mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 - Xác định biến đổi gen CYP2E1: Xác định số dạng biến đổi nucleotit đoạn promoter gen CYP2E1 Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu đánh giá đồng thời mức độ tiếp xúc, thấm nhiễm nhóm chất BTEX cơng nhân có tiếp xúc nghề nghiệp với dung môi hữu Việt Nam Luận án cơng trình nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng nhóm BTEX đến biểu mRNA gen CYP2E1 biến đổi đoạn promoter gen CYP2E1 ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Luận án đánh giá thực trạng tiếp xúc, thấm nhiễm ngƣời lao động số sở sản xuất sơn với nhóm chất BTEX Kết nghiên cứu luận án làm sở liệu cho Bộ Y tế đƣa quy định đầy đủ số giám sát môi trƣờng, giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với nhóm chất Luận án phát ảnh hƣởng nhóm BTEX làm tăng biểu mRNA gen CYP2E1, hàm lƣợng mRNA gen CYP2E1 có tƣơng quan tuyến tính với tổng giá trị tiếp xúc nhóm BTEX Kết nghiên cứu luận án làm sở khoa học cho việc đề xuất sử dụng số mRNA gen CYP2E1 làm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc đồng thời với nhóm chất BTEX Địa điểm thực luận án Khoa Sinh học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội; Trung tâm Sức khỏe Nghề nghiệp, Trạm quan trắc môi trƣờng Lao động Viện khoa học An toàn Vệ sinh lao động CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 KHÁI NIỆM DUNG MƠI HƢU CƠ, TÍNH CHẤT CỦA BTEX Dung mơi hữu nhóm chất hóa học, khác cấu trúc nhƣng có chung đặc tính quan trọng nhƣ tồn dạng lỏng dễ bay nhiệt độ thƣờng, gây độc hệ thần kinh trung ƣơng tiếp xúc thời gian dài, môi trƣờng công nghiệp với nồng độ cao Hiện nay, dung môi hữu đƣợc sử dụng nhiều ngành công nghiệp đặc biệt công nghiệp sơn, da giày số dung môi nhƣ toluen (T), ethylbenzen (E), xylen (X) chất phổ biến Bên cạnh đó, benzen (B) dung môi bị cấm sử dụng cơng nghiệp, nhiên khó để loại trừ hồn tồn benzen thành phần toluen, ethylbenzen xylen thƣờng chứa lƣợng benzen định Do làm việc ngành cơng nghiệp có sử dụng VOCs ngƣời lao động thƣờng chịu ảnh hƣởng đồng thời nhiều chất đặc biệt nhóm benzen, toluen, ethylbenzen xylen (BTEX) 1.2 GIÁM SÁT SINH HỌC Hiện nay, số nƣớc nhƣ Anh, Pháp, Thụy Sỹ, Hàn Quốc sử dụng số axit t,t-muconic (TTMA), O-cresol, axit mandelic (MA) + axit phenylglyoxylic (PGA), làm tiêu giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với benzen, O-cresol, methylhippuric (mHA) lần lƣợt số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với B, T, E, X 1.3 ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI HỮU CƠ ĐẾN SỨC KHỎE CON NGƢỜI Dung mơi hữu nói chung nhóm (BTEX) nói riêng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời tiếp xúc với môi trƣờng có nồng độ vƣợt ngƣỡng cho phép Đối với nhóm BTEX, nhiều nghiên cứu chứng minh, gây ảnh hƣởng đến DNA tiếp xúc nồng độ thấp Khi tiếp xúc với BTEX gây bệnh thần kinh, thiếu máu, biến đổi DNA ung thƣ BTEX xâm nhập vào thể đƣợc chuyển hóa hệ thống enzym CYP450 có vai trị đặc biệt quan trọng enzym CYP2E1 Gen CYP2E1 (Cytochrome P450 family subfamily E member 1) nằm nhiễm sắc thể số 10 (hình 1.1), vị trí 10q/26.3, dài 14776 bp, bao gồm exon, intron hộp TATA điển hình… CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Người lao động: Gồm nhóm tiếp xúc (73 ngƣời) nhóm khơng tiếp xúc (đối chứng 45 ngƣời) làm việc sở sản xuất công ty địa bàn Hà Nội công ty may Hải Dƣơng - Thời gian nghiên cứu: từ 1/2016 đến 12/2018 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ Hóa chất phân tích BTEX mơi trƣờng, máu, nƣớc tiểu sản phẩm chuyển hóa BTEX nƣớc tiểu hóa chất hãng Sigma – Mỹ sử dụng cho phân tích lƣợng vết Hóa chất sử dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử hãng Thermo Fisher Scientific Thiết bị nghiên cứu Hệ thống máy sắc ký GC/FID/MS, HPLC, LC/MS Agilient Mỹ Máy phân tích cơng thức máu Sysmex 1000i Nhật Bản Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Mỹ); Máy Realtime PCR (StepOne™ Real-Time PCR, Mỹ), Máy vortex, tủ lạnh sâu -80 °C, -20 °C, máy điện di, máy soi gel chụp ảnh gel tự động, máy ly tâm lạnh, lị vi sóng… 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG * Phƣơng pháp phân tích nồng độ BTEX, S môi trƣờng làm việc đối tƣợng nghiên cứu - Phƣơng pháp phân tích: Sắc ký khí 1501:2003 - NIOSH * Lấy mẫu, bảo quản mẫu Mẫu máu nƣớc tiểu để phân tích BTEX sản phẩm chuyển hóa BTEX nƣớc tiểu đƣợc thực theo hƣớng dẫn ACGIH Mẫu máu để phân tích DNA biểu gen đƣợc thực theo hƣớng dẫn kit hãng Thermo Fisher Scientific – Mỹ * Phƣơng pháp phân tích nồng độ BTEX, S máu, nƣớc tiểu đối tƣợng nghiên cứu 2.3.4.1 Phương pháp phân tích BTEX S máu: 8007:2013 NIOSH 2.3.4.2 Phương pháp phân tích BTEX S nước tiểu: theo phương pháp Janasik cộng 2.3.4.3 Phương pháp phân tích sản phẩm chuyển hóa BTEX nước tiểu 2.3.4.4 Phương pháp phân tích cơng thức máu 2.3.4.5 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 2.3.4.6 Phương pháp khuếch đại gen phương pháp PCR 2.3.4.7 Phương pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 2.3.4.8 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 2.3.4.9 Phương pháp tổng hợp cDNA 2.3.4.10 Phương pháp xác định hàm lượng mRNA kỹ thuật Realtime PCR 2.3.4.11 Phân tích thống kê sinh học 2.4 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ Tiêu chuẩn đánh giá nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen styren môi trƣờng theo tiêu chuẩn 3733/2002 “Quyết định việc ban hành 21 tiêu chuẩn vệ sinh lao động, nguyên tắc 07 thông số vệ sinh lao động” đƣợc Bộ Y tế ban hành tiêu chuẩn ACGIH (Mỹ) 2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU - Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc thông báo đầy đủ nội dung, mục đích nghiên cứu - Trong trình nghiên cứu đối tƣợng đƣợc đảm bảo an toàn tuyệt đối - Đối tƣợng nghiên cứu tự nguyện tham gia từ chối lúc trình nghiên cứu CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH NỒNG ĐỘ BTEX VÀ STYREN Phân tích nồng độ BTEX mơi trƣờng lao động đối tƣợng nhóm tiếp xúc, thu đƣợc kết nhƣ sau: Nồng độ benzen trung bình (TB) 73 đối tƣợng nghiên cứu 1,49 ± 1,54 mg/m3(0,1 - 6,12 mg/m3), từ khoảng giá trị cho thấy làm sở nhƣng có ngƣời tiếp xúc với benzen nồng độ thấp 0,1 mg/m3, có ngƣời tiếp xúc với benzen nồng độ cao 6,12 mg/m3, có 3/73 (4,11%) đối tƣợng có nồng độ benzen cao tiêu chuẩn cho phép (TCCP) Việt Nam (≥ (mg/m3) Tuy nhiên so với TCCP ACGIH (Mỹ) có đến 22/73 (30,14%) đối tƣợng tiếp xúc với benzen cao TCCP Kết nghiên cứu cho thấy giá trị cho phép nồng độ benzen môi trƣờng sản xuất Việt Nam cao Mỹ lần Phân tích việc tiếp xúc với benzen theo vị trí làm việc cho thấy ngƣời lao động làm việc vị trí pha chế có nồng độ benzen TB 2,28 mg/m3, cao nồng độ benzen TB ngƣời ngƣời động làm việc vị trí kiểm tra đóng gói (0,64 mg/m3) nhiều Nhóm cơng nhân làm việc vị trí pha chế có 20/41 (tƣơng ứng 48,78%) số đối tƣợng tiếp xúc với benzen vƣợt TCCP Nhóm kiểm tra, đóng gói có 2/32 đối tƣợng (tƣơng ứng 6,25%) tiếp xúc với benzen vƣợt tiêu cho phép Nồng độ toluen TB 73 đối tƣợng nghiên cứu 62,41± 43,01 mg/m3(2,24 - 150,98 mg/m3), với khoảng giá trị cho thấy làm sở nhƣng có ngƣời tiếp xúc với toluen nồng độ thấp 2,24 (mg/m3), có ngƣời tiếp xúc với toluen nồng độ cao 150,98 (mg/m3) Đánh giá việc tiếp xúc với toluen cá nhân, kết cho thấy có 17/73 (23,28%) đối tƣợng có nồng độ toluen cao TCCP Việt Nam (≥ 100 mg/m3) Tuy nhiên so với TCCP ACGIH (Mỹ) số đối tƣợng tiếp xúc với toluen vƣợt TCCP cao nhiều 37/73 (50,68%) Phân tích nồng độ toluen theo vị trí làm việc cho thấy nhóm pha chế có số đối tƣợng tiếp xúc với toluen nồng độ chuẩn ACGIH) 82,19% cần có biện pháp bảo vệ để phòng tránh bệnh nghề nghiệp Phân tích giới hạn nồng độ tiếp xúc với BTEX nhóm pha chế nhóm kiểm tra đóng gói, nhận thấy kết thu đƣợc tƣơng tự nhƣ mức độ tiếp xúc nhóm tiếp xúc với dung môi B, T, E, X (bảng 3.1 đến bảng 3.6) – nhóm pha chế ln cao nhóm kiểm tra, đóng gói Nhóm pha chế có 41/41 (100%) đối tƣợng nghiên cứu có giới hạn nồng độ tiếp xúc vƣợt TCCP, cao nhóm kiểm tra, đóng gói có 19/32 đối tƣợng (59,38%) Nhóm pha chế có ngƣời lao động mà giá trị giới hạn nồng độ tiếp xúc cao (6,3) cao gấp 2,5 lần giá trị giới hạn nồng độ tiếp xúc đối tƣợng cao nhóm kiểm tra, đóng gói 3.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu ngƣời lao động có tuổi nghề từ năm trở lên với khoảng thời gian đảm bảo thời gian tiếp xúc tối thiểu cho việc đánh giá ảnh hƣởng DMHC lên đối tƣợng nghiên cứu Bên cạnh tuổi đời, tuổi nghề, giới tính ln yếu tố chịu ảnh hƣởng khác dƣới tác động chất hóa học nói chung, nhóm BTEX nói riêng, chúng tơi đánh giá đặc điểm tuổi đời, tuổi nghề, giới tính đối tƣợng nghiên cứu Phân tích đặc điểm tuổi đời, tuổi nghề, giới tính đối tƣợng nghiên cứu cho thấy tuổi đời, tuổi nghề tỉ lệ giới tính nhóm tiếp xúc nhóm khơng tiếp xúc tƣơng đƣơng Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê tuổi đời TB nhƣ tuổi nghề TB nhóm Nhóm tiếp xúc có tuổi nghề TB 20 ± 8,68 (năm) gần tƣơng đƣơng với tuổi nghề TB nhóm khơng tiếp xúc 18,22 ± 5,48 (năm) Tuổi 11 đời TB nhóm xấp xỉ 42 tuổi Sự tƣơng đồng nhóm tiếp xúc nhóm khơng tiếp xúc tuổi đời tuổi nghề đảm bảo tính khách quan cho việc đánh giá kết nghiên cứu 3.3 NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MÁU VÀ NƢỚC TIỂU CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3.3.1 Nồng độ BTEX máu đối tƣợng nghiên cứu Khi đối tƣợng nghiên cứu tiếp xúc với BTEX, dung môi thấm nhiễm vào thể theo đƣờng qua da đặc biệt theo đƣờng hô hấp Chỉ sau tiếng tiếp xúc, nồng độ BTEX xuất máu nƣớc tiểu Chúng tơi phân tích nồng độ BTEX máu đối tƣợng nghiên cứu thu đƣợc kết cho thấy tiếp xúc với BTEX chất xâm nhập hay thấm nhiễm vào thể nhóm BTEX xuất máu đối tƣợng nghiên cứu Nồng độ benzen TB máu đối tƣợng 5,30 µg/L, cao TCCP Việt Nam (5 µg/L), với khoảng giá trị thu đƣợc 0,21 - 25,26 (µg/L), có 24/73 (32,88%) đối tƣợng có nồng độ benzen máu cao TCCP Nồng độ toluen TB máu thu đƣợc 18,32 µg/L, thấp TCCP ( 20 µg/L) với khoảng giá trị thu đƣợc 1,06 - 61,22 µg/L Việt Nam nhƣ nhiều nƣớc sử dụng số nồng độ toluen máu làm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với toluen Đánh giá theo nồng độ toluen máu cho thấy có 26/73 (35,62%) đối tƣợng có nồng độ toluen máu cao TCCP Nồng độ xylen TB máu thu đƣợc 3,5 (µg/L) với khoảng giá trị từ 0,15 đến 18,12 (µg/L) Việt Nam nhƣ nhiều nƣớc giới không sử dụng nồng độ xylen máu làm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp, 12 khơng có mối tƣơng quan với nồng độ xylen môi trƣờng lao động Kết thu đƣợc cho thấy ngƣời lao động tiếp xúc với xylen dù nồng độ cho phép xylen xâm nhập vào thể Đối với ethylbenzen, nồng độ ethylbenzen máu khơng có mối tƣơng quan với nồng độ ethylbenzen môi trƣờng lao động nên không đƣợc sử dụng làm số giám sát cho ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp Kết nghiên cứu cho thấy ngƣời lao động tiếp xúc với ethylbenzen ethylbenzen xâm nhập vào thể (nồng độ ethylbenzen máu TB 7,96 (µg/L), với khoảng giá trị thu đƣợc 0,23 - 30,25 µg/L 3.3.2 Nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen xylen nƣớc tiểu đối tƣợng nghiên cứu Phân tích nồng độ BTEX nƣớc tiểu đối tƣợng nghiên cứu chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau: Trong nhóm BTEX đƣợc xét nghiệm nƣớc tiểu có số toluen niệu đƣợc nhiều nƣớc giới sử dụng làm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với toluen Bảng 3.10 cho thấy có 20/73 (27,4 %) ngƣời có nồng độ toluen niệu cao TCCP, với giá trị TB 19,09 µg/L, khoảng giá trị thu đƣợc từ 0,78 - 42,31 µg/L Đối với dung mơi B, E, X không sử dụng làm số giám sát sinh học nƣớc tiểu Tuy nhiên với kết thu đƣợc cho thấy BTEX xâm nhập vào thể phần lớn đƣợc chuyển hóa nhƣng cịn phần nhỏ khơng đƣợc chuyển hố đào thải ngun dạng qua nƣớc tiểu 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SẢN PHẨM CHUYỂN HĨA CỦA BTEX 13 Chúng tơi phân tích sản phẩm chuyển hóa TTMA, Ocresol, mHA tổng MA+PGA, kết thu đƣợc nồng độ cụ thể chất đối tƣợng đƣợc trình bày từ bảng 3.11 đến 3.14 Bảng 3.2 Kết phân tích sản phẩm chuyển hóa BTEX nƣớc tiểu Các giá trị Dung môi hữu Benzen Toluen Xylen Ethylbenzen Chỉ số giám sát sinh học mg/g cre TTMA O-cresol mHA MA +PGA Số mẫu phân tích Số mẫu khơng phát 73 73 73 0 73 Số mẫu vƣợt TCCP Việt Nam* Số % mẫu 0 31 42,46 0 - - Số mẫu vƣợt TCCP ACGIH Mỹ ** Số % mẫu 23 31,5 31 42,46 0 22 30,14 Chú thích;* Tiêu chuẩn cho phép nồng độ TTMA, O-cresol, mHA, Việt Nam ≤ 500; 0,3; 1500; mg/g creatinin ** Tiêu chuẩn cho phép nồng độ TTMA, ocresol, mHA, (MA+PGA) ACGIH ≤ 0,5; 0,3; 1500; 150 mg/g creatinin; Kết phân tích sản phẩm chuyển hóa nhóm BTEX đối tƣợng nghiên cứu (bảng 3.15) thể tình trạng thấm nhiễm vƣợt TCCP BTEX thể ngƣời lao động cở sở sản xuất sơn Nếu theo TCCP Việt Nam số ngƣời vƣợt TCCP thể nồng độ O-cresol, tức vào số giám sát sinh học Việt Nam số đối tƣợng nghiên cứu có 31/73 (42,46%) vƣợt TCCP O - cresol, số khác nằm TCCP không đƣợc quy định Tuy nhiên theo TCCP ACGIH số đối tƣợng có nồng độ số giám sát sinh học cao nhiều: 31,5% số giám sát sinh học TTMA, 42,46% số giám sát sinh học O-cresol, 30,14% số giám sát sinh học ethylbenzen 14 3.5 ẢNH HƢỞNG CỦA BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN ĐẾN BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN CYP2E1 Kết phân tích biểu gen CYP2E1 Realtime PCR hai nhóm tiếp xúc khơng tiếp xúc đƣợc đánh giá mức độ biểu theo số: ct, ΔCt, 2-ΔCt Chỉ số 2-ΔCt biểu thị tỷ lệ biểu gen CYP2E1 mẫu tiếp xúc so với khơng tiếp xúc Kết đƣợc trình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Kết phân tích biểu mRNA gen CYP2E1 Khoảng Khoảng tin Trung Nhóm n P giá trị cậy CI vị (2-ΔCt) 95% 0,6 Nhóm tiếp xúc 73 4,5 3,58 - 5,90 160,9 Nhóm khơng tiếp 0,11 45 0,43 0,35 - 0,54 < xúc 1,64 0,001 Mức độ biểu nhóm tiếp xúc (TX) so với nhóm khơng tiếp 10,47 xúc (KTX) Từ kết bảng 3.17 nhận thấy số liệu mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 thông qua giá trị 2-ΔCt không phân bố theo phân phối chuẩn (giá trị TB 2-ΔCt 19,00; trung vị 4,5 độ dốc 2,86), lựa chọn việc phân tích số liệu theo phƣơng pháp phi tham số, để đánh giá mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 Kết cho thấy nhóm tiếp xúc có giá trị trung vị 4,5; giá trị CI 95% từ 3,58 - 5,9, nhóm khơng tiếp xúc có giá trị trung vị 0,43; giá trị CI 95% khoảng 0,35 - 0,54 (bảng 3.17) khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,001) Kết thu đƣợc thể nhóm tiếp xúc có mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 cao 10,47 lần so với nhóm khơng tiếp xúc 15 3.5.2 Mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 chia theo tuổi đời, tuổi nghề đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu có tuổi đời từ 20 đến 60, nằm độ tuổi lao động, xác định mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 chia theo tuổi đời đối tƣợng nghiên cứu thành nhóm có khoảng cách cách 10 tuổi Kết cho thấy mức độ biểu CYP2E1 nhóm tuổi đời khác nhóm tiếp xúc khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Kết nghiên cứu cho thấy tuổi đời đối tƣợng không ảnh hƣởng đến mức độ hiểu mRNA CYP2E1 Phân tích mức biểu mRNA gen CYP2E1 chia theo nhóm tuổi đời nhóm khơng tiếp xúc, kết cho thấy mức độ biểu CYP2E1 nhóm tuổi đời khác nhóm khơng tiếp xúc khơng có khác biệt (P > 0,05) Từ kết phân tích biểu mRNA nhóm tiếp xúc, khơng tiếp xúc, phạm vi nghiên cứu chúng tơi có nhận định tuổi đời không ảnh hƣởng đến mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 Tƣơng tự nhƣ cách phân tích biểu mRNA gen CYP2E1 theo tuổi đời phân tích biểu mRNA gen CYP2E1 theo tuổi nghề kết cho thấy phạm vi nghiên cứu chƣa phát ảnh tuổi nghề - thời gian tiếp xúc đến biểu mRNA gen CYP2E1.Tức cho dù thời gian tiếp xúc dài hay ngắn, tuổi đời cao hay thấp tiếp xúc với benzen, toluen, ethylbenzen xylen làm tăng mức độ biểu CYP2E1 3.6 MỐI TƢƠNG QUAN CỦA NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MÔI TRƢỜNG VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC TRONG CƠ THỂ Kết phân tích nồng độ BTEX mơi trƣờng, nồng độ BTEX máu, nƣớc tiểu sản phẩm chuyển hóa BTEX nƣớc tiểu cho thấy chƣa có giám sát sinh học đáp ứng đƣợc 16 yêu cầu đánh giá cho việc ngƣời lao động đồng thời tiếp xúc với đồng thời chất nhóm BTEX, mà có giám sát cho chất riêng lẻ Ngồi việc đánh giá ảnh hƣởng nhóm BTEX đến mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 luận án mong muốn tìm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động đồng thời tiếp xúc với nhóm chất BTEX Chúng tơi phân tích tìm mối tƣơng quan nồng độ BTEX môi trƣờng với nồng độ BTEX máu, nƣớc tiểu, sản phẩm chuyển hóa BTEX mức độ biểu mRNA CYP2E1 Bên cạnh phân tích mối tƣơng quan nồng độ giới hạn tiếp xúc BTEX mức độ biểu mRNA CYP2E1 chia theo vị trí việc làm nhóm tiếp xúc kết cho thấy nồng độ giới hạn tiếp xúc BTEX có tƣơng quan chặt chẽ với mức độ biểu mRNA CYP2E1 (hệ số tƣơng quan R = 0,87) Bên cạnh giá trị nồng độ giới hạn tiếp xúc BTEX không tƣơng quan với sản phẩm chuyển hóa chất riêng lẻ (các hệ số tƣơng quan thấp nhƣ R = -0,05 – nồng độ mHA; R = 0,06 với nồng độ MA + PGA) Hệ số tƣơng quan nồng độ TTMA niệu với giới hạn tiếp xúc BTEX (R = 0,73) tƣơng đối cao, nhiên không chặt chẽ mối tƣơng quan giá trị giới hạn tiếp xúc BTEX với mức độ biểu mRNA CYP2E1 Nghiên cứu cho thấy số mRNA gen CYP2E1 số phù hợp, dùng cho giám sát sinh học, ngƣời lao động có tiếp xúc với nhiều dung mơi hữu nói chung, cụ thể nhóm BTEX nói riêng Tuy nhiên, mức độ biểu mRNA CYP2E1 (2-ΔCt) đƣa cảnh báo để bảo vệ ngƣời lao động cần có nghiên cứu với phạm vị lớn - số mẫu lớn số lần lặp lại đối tƣợng nhiều 17 3.7 XÁC ĐỊNH SỰ BIẾN ĐỔI CỦA GEN CYP2E1 Sau tách tinh đoạn DNA mẫu đƣợc giải trình tự, phân tích đa hình Kết trình bày bảng 3.36 Bảng 3.36 Tần số đa hình, tần số alen quần thể nghiên cứu Nhóm Vị trí Kiểu Nhóm tiếp Giá TT khơng tiếp SNP gen/Alen xúc (n/%) trị P xúc (n/%) GG 53 (72,6) 29 (64,4) GC 16 (21,9) 15 (33,3) 0,21 3739 CC (5,5) (2,3) 0,48 G>C G 83,6% 81% 0,63 C 16,4% 19% 3620 C>T 3519 T>G 3468 T>A CC 72 (98,6) 45 (100) CT (1,4) (0) TT (0) (0) C 99,3% 100% T TT TG 0,7% 21 (28,8) 32 (43,8) 0% 13 (28,9) 23 (51,1) 0,74 GG 20 (27,4) (20) 0,55 T 50,1% 54,4% G TT TA AA 49,9% 52 (71,2) 14 (19,2) (9,6) 45,6% 29 (64,4) 13 (28,9) (6,7) T 80,8% 78,9% A 19,2% 21,1% 18 0,43 0,4 0,54 0,25 0,31 0,73 Điểm đa hình vị trí 3739 G> C SNP CYP2E1 3739(G>C) điểm đa hình nucleotide 3739 G đƣợc thay C, vị trí đƣợc xác định cách tính từ nucleotide chuỗi CYP2E1 với mã (NG_008383.1) Alen G đƣợc coi kiểu dại (dạng gốc), C biến thể (kiểu biến đổi) Kết bảng 3.36 cho thấy nhóm tiếp xúc nhóm khơng tiếp xúc khác biệt tần số kiểu gen GC (kiểu gen chứa alen biến thể) kiểu gen CC (kiểu gen đồng hợp chứa alen biến thể) so với kiểu gen đồng hợp GG (dạng gốc) khơng có ý nghĩa thống kê với P tƣơng ứng 0,21; 0,48 lớn 0,05 So sánh tần số alen G C nhóm tiếp xúc không tiếp xúc cho thấy kết tƣơng tự, khác biệt khơng có ý ngĩa thống kê (p =0,63) Điều cho thấy điểm đa hình vị trí 3739 (G> C) G đƣợc thay T, xuất nhóm tiếp xúc khơng tiếp xúc với tần số cao, khơng có khác biệt Tức xuất điểm đa hình khơng liên quan đến việc đối tƣợng nghiên cứu có tiếp xúc với dung mơi hữu hay khơng Tƣơng tự nhƣ vị trí đa hình 3620 C > T; 3519 T> G; 3468 T> A chƣa phát có liên quan đến tiếp xúc với dung mơi hữu Mặc dù chƣa tìm đƣợc mối liên hệ đa hình tìm đƣợc trình tự đoạn promoter, gen CYP2E1 đối tƣợng công nhân làm việc công ty sản xuất sơn, bị phơi nhiễm với dung môi hữu nhƣ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen Việt Nam, nhƣng việc phát phân tích đa hình trình tự promoter gen CYP2E1 có ý nghĩa nghiên cứu mức độ biểu gen ảnh hƣởng đến sức khỏe công nhân làm ngành công nghiệp nhằm đảm bảo tăng cƣờng an toàn nghề nghiệp ngƣời lao động 19 3.7.3 Mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 chia theo điểm đa hình Sau phát điểm đa hình 3739 G>C; 3620 C>T; 3519 T>G; 3468 T>A, chúng tơi phân tích để tìm hiểu mức độ biểu gen điểm đa hình Kết thu đƣợc trình bày từ bảng 3.37 đến bảng 3.39 Bảng 3.39 Kết phân tích biểu mRNA gen CYP2E1 điểm đa hình 3739 G>C nhóm tiếp xúc Kiểu gen SNP 3739 G>C GG GC CC Tổng n 53 16 73 Khoảng giá trị đƣợc (2-ΔCt) Trung vị 0,6 – 150,12 1,16 – 160,19 3,18 – 18,25 4,47 4,62 9,52 95% CI P 3,29 – 7,01 3,52 – 26, 46 > 0,05 3,18 – 18,25 > 0,05 Phân tích mối liên quan biến đổi gen với biểu gen điểm đa hình (SNP) 3739, thu đƣợc mức độ biểu mRNA kiểu gen GG (kiểu gen gốc) với kiểu gen GC (kiểu gen chứa alen biến thể) kiểu gen GG với kiểu gen CC GC (kiểu gen chứa alen biến thể) chƣa có khác biệt có ý nghĩa thống kê, (P> 0,05) Mặc dù nhƣng kết thu đƣợc cho thấy nhóm đối tƣợng có kiểu gen CC (chứa alen biến thể) có mức độ biểu cao cao gấp lần so với kiểu gen GG GC Kết phân tích biểu mRNA gen CYP2E1 điểm đa hình cịn lại 3468 T>A; 3519 T>G; 3260 (C>T) cho thấy có khác biệt mức độ biểu mARN CYP2E1 cá thể mang alen biến thể so với cá thể mang kiểu gen gốc nhiên khơng có ý nghĩa thống kê 20 3.7.4 Tình trạng thiếu máu tiếp xúc với dung môi hữu đối tƣợng nghiên cứu Đặc trƣng tình trạng thiếu máu ảnh hƣởng nhóm BTEX suy giảm ba dòng tế bào (tế bào hồng cầu, tế bào bạch cầu tế bào tiểu cầu) Để xác định ảnh hƣởng nhóm BTEX đến tình trạng thiếu máu đối tƣợng nghiên cứu tiến hành phân tích đếm số lƣợng loại tế bào Khi phân tích theo giới ảnh hƣởng nhóm BTEX đến thiếu máu – thơng qua suy giảm dòng tế bào máu riêng rẽ, chúng tơi chƣa phát ảnh hƣởng nhóm BTEX Tuy nhiên, đánh giá suy giảm dòng tế bào tổng số đối tƣợng nghiên cứu chúng tơi nhận thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê tế bào bạch cầu (p < 0,05), nhóm tiếp xúc có nguy suy giảm dịng tế bào bạch cầu cao gấp 8,26 lần so với nhóm khơng tiếp xúc Sự suy giảm dịng tế bào tiểu cầu có khác biệt nhóm tiếp xúc nhóm so sánh (có 12/73 đối tƣợng nhóm tiếp xúc bị suy giảm dịng tế bào tiểu cầu, nhóm khơng tiếp xúc khơng có đối tƣợng nào) Kết cho phép nhận định suy giảm dòng tế bào bạch cầu, tiểu cầu nhóm tiếp xúc ảnh hƣởng BTEX, hay nói cách khác tiếp xúc với BTEX gây tƣợng thiếu máu đối tƣợng nghiên cứu thể rõ qua suy giảm dòng tế bào bạch cầu Tuy nhiên tƣợng thiếu máu mức nhẹ, mức độ suy giảm dịng tế bào < 15% Khi phân tích theo số đối tƣợng suy giảm dòng tế bào chúng tơi thu đƣợc kết có khác biệt nhóm tiếp xúc nhóm khơng tiếp xúc có ý nghĩa thống kê (pC với mã rs3831867 mang kiểu gen GC CC có nguy thiếu máu cao gấp 10,45 lần so với ngƣời không mang alen biến thể Đối tƣợng có điểm đa hình 3519 T>G với mã rs8192766 mang kiểu gen TG GG có nguy thiếu máu cao gấp 12,5 lần so với ngƣời không mang alen biến thể Tƣơng tự điểm đa hình 3468 T>G với mã rs3813866, thể mang alen biến thể có nguy thiếu máu cao gấp 12,8 lần đối tƣợng không mang alen biến thể KẾT LUẬN Nồng độ BTEX môi trƣờng đơn vị nghiên cứu vƣợt tiêu chuẩn cho phép 30,14% benzen, 50,68% toluen, 30,14% ethylbenzen 82,19% giới hạn nồng độ tiếp xúc nhóm BTEX Mức độ thấm nhiễm dung mơi BTEX vào đối tƣợng nghiên cứu thông qua số giám sát sinh học nƣớc tiểu cao giới hạn cho phép: 31,5% axit t,t muconic - sản phẩm hóa benzen, 42,46% O-cresol - sản phẩm chuyển hóa 22 toluen, 30,14% nồng độ (axit mandelic + axit phenylglyoxylic) sản phẩm chuyển hóa ethylbenzen Nồng độ axit methyl hippuric sản phẩm chuyển hóa xylen nằm giới hạn cho phép Nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen môi trƣờng lao động sở nghiên cứu gây ảnh hƣởng mức độ biểu mRNA gen CYP2E1 cao nhóm khơng tiếp xúc 10,47 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê Phát đa hình đơn nucleotide trình tự promoter gen CYP2E1: 3739G>C, 3519T>G, 3468T>A, 3620C>T, chƣa phát mối liên hệ ảnh hƣởng nhóm BTEX đến xuất điểm đa hình Mức độ biểu gen điểm đa hình tƣơng ứng với kiểu gen chƣa có khác biệt có ý nghĩa thống kê Nhóm tiếp xúc có nguy thiếu máu cao nhóm khơng tiếp xúc 4,14 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê Các đối tƣợng nghiên cứu phát đồng thời mang hai alen biến thể bị thiếu máu KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu đề đề xuất sử dụng số mRNA gen CYP2E1 làm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với nhóm BTEX Tiếp tục nghiên cứu với quy mơ lớn để xác định vai trị đa hình đến việc chuyển hóa, đào thải benzen, toluen, ethylbenzen, xylen, nhƣ ảnh hƣởng benzen, toluen, ethylbenzen, xylen đến kiểu gen đa hình Từ làm sở cho việc khuyến cáo, bố trí cơng việc phù hợp cho đối tƣợng mang kiểu gen có nguy nhiễm độc với benzen, toluen, xylen, hạn chế bệnh nghề nghiệp 23 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thị Thanh Huyền (2017), “Đánh giá thực trạng tiếp xúc với benzen, toluen ngƣời lao động số nhà máy sản xuất sơn giầy da”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T.33(1S), tr 200-206 Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Cẩm Nhung, Nguyễn Phú Hùng, Nguyễn Thị Hồng Vân, Bùi Phƣơng Thuận, Nguyễn Quang Huy (2018), “Đa hình trình tự promoter genCYP2E1 đối tƣợng công nhân ngành sản xuất sơn bị phơi nhiễm với dung mơi hữu cơ”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T.34(4), tr 89-96 Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Cẩm Nhung, Nguyễn Phú Hùng, Bùi Phƣơng Thuận, Nguyễn Quang Huy (2019), “Mối liên quan biểu mRNA gen CYP2E1 với giới hạn nồng độ tiếp xúc benzen, toluen, xylen ethylbenzen cơng nhân sản xuất sơn”, Tạp chí hoạt động khoa học cơng nghệ An tồn – Sức khỏe môi trường lao động, (1,3&3), tr 17-23 Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Cẩm Nhung, Nguyễn Phú Hùng, Bùi Phƣơng Thuận, Nguyễn Quang Huy (2019), “Biểu gen CYP2E1 ngƣời lao động sở sản xuất sơn có tiếp xúc nghề nghiệp với dung mơi hữu cơ”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T.35(3), tr 71-79 24 14 ... nghiệp, đặc biệt mong muốn tìm số giám sát sinh học cho ngƣời lao động có tiếp xúc với BTEX thực nghiên cứu : ? ?Nghiên cứu ảnh hƣởng số dung môi hữu đến Cytochrom P450 ngƣời lao động có tiếp xúc. .. nhiên việc nghiên cứu số giám sát sinh học cho ngƣời lao động tiếp xúc với nhóm chất nhƣ BTEX chƣa đƣợc quan tâm Nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi hữu đến ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp có nhƣng... xúc nghề nghiệp? ?? Mục tiêu luận án - Xác định đƣợc mức độ thấm nhiễm số dung môi hữu ngƣời lao động có tiếp xúc nghề nghiệp - Xác định đƣợc ảnh hƣởng số loại dung môi hữu lên biểu gen cytochrom P450