Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng ipsc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 THÁI NGUYÊN, 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÙY LINH Tên đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: K47 – CNSH Chuyên ngành: CNSH - CNTP Khóa học: 2015 – 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Xuân Hưng PGS.TS Dương Văn Cường THÁI NGUYÊN, 2019 i LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Hưng – Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào gốc công nghệ gen Vinmec PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Ngun tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh – kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc công nghệ gen Vinmec, người trực tiếp hướng dẫn thực đề tài nghiên cứu Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến cán Viện nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ gen TS Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan… hỗ trợ nhiệt tình cho tơi q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thầy cô, cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, người giúp đỡ, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho suốt thời gian qua Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thùy Linh ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi tế bào gốc vạn cảm ứng 10 Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm biệt hóa 11 Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng thí nghiệm 21 Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 3.3: Dụng cụ vật tư dùng thí nghiệm 24 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm Flow cytometry 28 Bảng 3.5: Thành phần vector tái lập trình pCEB-hUL-G pCEB-hSK-O 29 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 35 Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng thí nghiệm 37 Bảng 3.9 Thành phần phản ứng Real time PCR 37 Bảng 4.1: Kết thu độ tinh nồng độ DNA plasmid mini 39 Bảng 4.2: Kết thu độ tinh nồng độ DNA plasmid maxi 40 Bảng 4.3: Kết đo OD sau lần tách RNA 50 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc Hình 2.2: Lịch sử đời tế bào gốc vạn cảm ứng Hình 2.3: Ứng dụng iPSC lĩnh vực trị liệu gen, mơ hình bệnh khám phá thuốc Hình 2.4: Cấu trúc miền protein OCT4 12 Hình 2.5: Cấu trúc miền protein SOX2 .13 Hình 2.6: Cấu trúc miền protein KLF4 14 Hình 2.7: Cấu trúc miền protein MYC .15 Hình 2.8: Cấu trúc miền protein LIN28 .16 Hình 2.9: Cấu trúc miền protein GLIS1 .17 Hình 2.10: Một số loại tế bào dùng để tạo iPSC 18 Hình 2.11: So sánh phương pháp biểu gene tái lập trình 20 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm đề tài 25 Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình 28 Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA 36 Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR .37 Hình 4.1: Kết tách chiết DNA plasmid mini 39 Hình 4.2: Kết tách chiết DNA plasmid maxi .40 Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau rã đông 41 Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau ngày nuôi tăng sinh 42 Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau ngày nuôi tăng sinh 43 Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau ngày nuôi tăng sinh 43 Hình 4.7 Sự biểu tế bào CD34 bề mặt quần thể tế bào nuôi tăng sinh 45 Hình 4.8: Tế bào sau ngày xung điện 47 Hình 4.9: Quần thể tế bào sau ngày chuyển gen (A), sau ngày chuyển gen (B) sau ngày chuyển gen (C) 48 iv Hình 4.10: Tế bào sau ngày xung điện 49 Hình 4.11: Quần thể tế bào sau ngày chuyển gen (A), sau ngày chuyển gen (B), sau ngày chuyển gen (C) 49 Hình 4.12: (A)Biểu gen SOX2-KLF4 LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O pCEB-hUL-G 51 v DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ đầy đủ Từ viết tắt BSA Bovine serum albumin cDNA complementary DNA DMSO dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli ESC Embryonic stem cell hiPSC Human induced pluripotent stem cell HMG High mobility group HSC Hematopoietic stem cell ICM Inner cell mass iPSC Induced pluripotent stem cell LB Laria Broth mESC Mouse embryonic stem cell PBMC Peripheral blood mononuclear cell PCR Polymerase chain reaction qRT-PCR Quantitative polymerase chain reaction Ref Reference RNA Ribonucleic acid RT Reverse transcription Tg Target vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v Phần MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1.Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tế bào gốc 2.1.2 Lịch sử đời tế bào gốc vạn cảm ứng 2.1.3 Phân loại tế bào gốc 2.2 Các nhân tố tái lập trình 12 2.2.1 OCT4 12 2.2.2 SOX2 13 2.2.3 KLF4 14 2.2.4 MYC 15 2.2.5 LIN28 16 2.2.6 GLIS1 17 2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC 18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 vii 3.1.2 Địa điểm thời gian 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Vật liệu 21 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu .25 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .39 4.1 Kết nhân plasmid lần 39 4.2 Kết nhân plasmid lần .40 4.3 Kết nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 41 4.4 Kết nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 43 4.5 Hình thái chất lượng tế bào sau chuyển gen lần .46 4.6 Hình thái chất lượng tế bào sau chuyển gen lần .48 4.7 Kết kiểm tra biểu gen 50 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Tế bào CD34+ sau nuôi tăng sinh ngày đạt tổng số tế bào 0,46 x 106 tế bào Tổng cộng µg plasmid (500 ng plasmid ULG 500 ng plasmid SKO) chuyển vào 106 tế bào phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) Tế bào sau chuyển gen nuôi đĩa giếng phủ chất ngoại bào thương mại (CELLstart) nuôi điều kiện 37o/5 % CO2 Tế bào ngày sau chuyển gen biểu hình 4.8 Có dạng tế bào điển hình xuất hiện: Hình 4.8: Tế bào sau ngày xung điện i Dạng thứ quan sát tế bào tròn, sáng chiếm phần lớn số lượng tế bào đĩa (mũi tên vàng) Có thể quần thể tế bào gốc tạo máu ii Dạng thứ hai quan sát tế bào có hình dạng tương tự ngun bào sợi có hình dạng hình thoi thuôn dài (mũi tên đen) Có thể quần thể tế bào gốc trung mơ có lẫn quần thể tế bào ban đầu độ tinh quần thể tế bào trước chuyển gen không đạt 100% 48 Tế bào ngày thứ 2, thứ thứ sau chuyển gen thể hình 4.9 Hình 4.9: Quần thể tế bào sau ngày chuyển gen (A), sau sau ngày chuyển gen (B) sau ngày chuyển gen (C) Có thể thấy số lượng tế bào tròn, sáng tăng lên tạo thành cụm tế bào, rõ ràng ngày Số lượng tế bào hình thoi dài ngày thứ sau chuyển gen xuất nhiều mọc trải khắp bề mặt giếng nuôi cấy Điều cho thấy tế bào tồn sẵn quần thể tế bào chuyển gen chất sử dụng để phủ đĩa điều kiện thuận lợi để chúng bám tăng sinh, chúng tơi dự đốn tế bào khơng phải tế bào mong muốn hình thái tế bào gốc tạo máu khơng có tế bào thn dài mà có quần thể tế bào trịn, sáng Tuy nhiên chúng tơi tách RNA để kiểm tra biểu gene Do đó, tiếp tục chuyển gen lần thứ với lượng DNA plasmid lượng tế bào cao để mong muốn đạt chất lượng tế bào tốt 4.6 Hình thái chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 106 tế bào chuyển gen lần với µg plasmid (1 µg plasmid chứa yếu tố phiên mã ULG µg plasmid chứa yếu tố phiên mã SKO) phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) Tế bào sau chuyển gen nuôi giếng đĩa giếng (3,3 x 105 tế bào/giếng) phủ chất ngoại bào thương mại (CELLstart) ni điều kiện 37℃/5 % CO2 49 Hình 4.10: Tế bào sau ngày xung điện Hình ảnh chụp tế bào kính hiển vi quang học ngày sau chuyển gen trình bày hình 4.10 Phần lớn tế bào quan sát đĩa tế bào trịn, sáng điển hình tế bào gốc tạo máu Dạng thứ hai quan sát tế bào chết có hình trịn, màu đen kết dự đoán trước sử dụng xung điện với cường độ cao Tỉ lệ tế bào chết xác định cách đếm với thuốc nhuộm Trypan blue cho thấy chúng chiếm khoảng 20% so với tổng số tế bào Tế bào ngày thứ 4, thứ ngày sau chuyển gen thể hình 4.11 Hình 4.11: Quần thể tế bào sau ngày chuyển gen (A), sau ngày chuyển gen (B), sau ngày chuyển gen (C) 50 Có thể thấy số lượng tế bào trịn, sáng chiếm ưu sau ngày chuyển gen (Hình 4.11 A) Tuy nhiên, đến ngày thứ (hình 4.11 B), ta thấy bắt đầu xuất tế bào bám xuống bề mặt đĩa nuôi cấy (mũi tên vàng) Những tế bào bám bắt đầu có hình dạng giống với tế bào biểu mô mọc thành cụm vào ngày (hình 4.11 C) Nhóm nghiên cứu hi vọng sau tuần, khuẩn lạc tiền thân iPSC hình thành phát triển dần thành khuẩn lạc giống kiểu hình iPSC đánh giá phương pháp kiểm định phù hợp 4.7 Kết kiểm tra biểu gen ngày sau chuyển gen, toàn tế bào giếng sử dụng để tách chiết RNA phục vụ cho phản ứng Real-time PCR để kiểm tra biểu gen chuyển RNA từ tế bào gốc tạo máu không chuyển gen cũng tách chiết để làm nhóm đối chứng Kết tách chiết RNA trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết đo OD sau lần tách RNA Tế bào sau ngày chuyển gen lần thứ (1 µl) 17,9 Tế bào sau ngày chuyển gen lần thứ hai (2 µl) Conc (ng/µl) Tế bào nuôi tăng sinh ngày 35,1 A260/280 1,95 2,13 1,85 Nồng độ chất lượng RNA 12,2 Từ kết cho thấy, mẫu tách có độ tinh nằm khoảng 1.8-2.1, riêng tế bào sau ngày chuyển gen (1 µl) A260/280 đạt 2,13 vượt qua khoảng 1.8-2.1, nhiên độ chênh lệch khơng đáng kể nên tiến hành phản ứng Real time PCR 135ng RNA từ mẫu tế bào đối chứng mẫu tế bào chuyển gen sử dụng để tổng hợp cDNA µl cDNA tổng số 20 µl phản ứng từ mẫu sử dụng phản ứng Real time PCR Kết Realtime PCR cho thấy: - Đối chứng âm (thay nước) phản ứng khuếch đại khơng xảy (không thể xác định giá trị Ct) Kết chứng tỏ thao tác chuẩn bị phản ứng không bị nhiễm chéo mẫu cặp mồi không tạo sản phẩm thứ cấp 51 - Điểm khác biệt thí nghiệm thay gen cặp mồi xi mồi ngược chúng tơi sử dụng cặp mồi xi SOX2 mồi ngược KLF4 để bắt vào hai đầu đoạn gen mã hóa cho SOX2-KLF4 vector SK-O tương tự cho cặp mồi L-MYC-LIN28 vector UL-G để tiết kiệm chi phí thời gian làm thí nghiệm Mức độ biểu gen GapDH kiểm tra Sự khác biệt mức độ biểu cặp gen SOX2-KLF4 L-MYC-LIN28 tế bào chuyển gen so với tế bào đối chứng tính tốn theo cơng thức Livak trình bày sơ đồ hình 4.12 Hình 4.12: (A)Biểu gen SOX2-KLF4, LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O pCEB-hUL-G Kết cho thấy, trục tung biểu số lần thay đổi sau chuyển gen (định mức theo gen chứng nội GapDH - gen có biểu đồng tất tế bào điều kiện thí nghiệm khác nhau) Trục hồnh biểu gen 52 SOX2-KLF4 LMYC-LIN28 sau lần chuyển gen với lượng chuyển gen µg plasmid (màu đỏ) µg plasmid (màu xanh) Biểu gen tái lập trình tăng nhiều so với tế bào không chuyển gen (control) Cụ thể, biểu chuyển gen với µg plasmid 106 tế bào CD34+ cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 30957 lần cặp gen L-MYC-LIN28 tăng khoảng 5841 lần, biểu chuyển gen với µg plasmid 106 tế bào CD34+của cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 26000 lần cặp gen L-MYC-LIN28 tăng khoảng 2900 lần Như kết luận chúng tơi chuyển thành cơng vector tái lập trình vào tế bào CD34 + phương pháp xung điện 53 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã biểu thành công gen SOX2-KLF4 L-MYC-LIN28 tế bào gốc tạo máu người 5.2 Kiến nghị - Sử dụng nguồn tế bào CD34+ có độ tinh cao để việc tái lập trình có hiệu suất cao dễ dàng tạo thành khuẩn lạc iPSC - Kiểm tra biểu gen GLIS1 OCT4 - Sử dụng tế bào máu ngoại vi để tái lập trình máu ngoại vi gây xâm lấn không đáng kể - Tiếp tục nuôi cấy để chờ khuẩn lạc iPSC để biệt hóa thành loại tế bào khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Phan Kim Ngọc (2008), Công nghệ tế bào gốc, Nxb Giáo Dục Việt Nam Tiếng anh A A Mack, S Kroboth, D Rajesh, and W B Wang (2011), “Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from CD34+ Cells across Blood Drawn from Multiple Donors with Non-Integrating Episomal Vectors,” PLoS One, vol 6, no 11, p 27956 A E Omole and A O J Fakoya (2018), “Ten years of progress and promise of induced pluripotent stem cells: historical origins, characteristics, mechanisms, limitations, and potential applications.,” PeerJ, vol 6, p e4370 A Kamath, S Ternes, S McGowan, A English, R Mallampalli, and A B Moy (2017), “Efficient method to create integration-free, virus-free, Myc and Lin28-free human induced pluripotent stem cells from adherent cells.,” Futur Sci OA, vol 3, no 3, p FSO211 D Maetzel et al (2014), “Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells.,” Stem cell reports, vol 2, no 6, pp 866–80 D Zeineddine, A A Hammoud, M Mortada, and H Boeuf (2014), “The Oct4 protein: more than a magic stemness marker.,” Am J Stem Cells, vol 3, no 2, pp 74–82 D W Scoville, H S Kang, and A M Jetten (2017), “GLIS1-3: emerging roles in reprogramming, stem and progenitor cell differentiation and maintenance,” Stem Cell Investig., vol 4, no 9, pp 80–80 G Huang, S Ye, X Zhou, D Liu, and Q.-L Ying (2015), “Molecular basis of embryonic stem cell self-renewal: from signaling pathways to pluripotency network.,” Cell Mol Life Sci., vol 72, no 9, pp 1741–57 F González, S Boué, and J C Izpisúa Belmonte (2011), “Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming la carte.,” Nat Rev Genet., vol 12, no 4, pp 231–42 10.G Lee et al (2012), “Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression,” Nat Biotechnol., vol 30, no 12, pp 1244–1248 11.G Nakanishi, Y.-S Kim, T Nakajima, and A M Jetten (2006), “Regulatory role for Krüppel-like zinc-finger protein Gli-similar (Glis1) in PMA-treated and psoriatic epidermis.,” J Invest Dermatol., vol 126, no 1, pp 49–60 12 I.-H Park et al (2008), “Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors,” Nature, vol 451, no 7175, pp 141– 146 13 I Heo, C Joo, J Cho, M Ha, J Han, and V N Kim (2008), “Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor MicroRNA.,” Mol Cell, vol 32, no 2, pp 276–84 14 H Vangapandu and W Ai (2009), “Kruppel like factor (KLF4): a transcription factor with diverse context-dependent functions,” 15 H Kanemura et al (2014), “Tumorigenicity Studies of Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration,” PLoS One, vol 9, no 1, p e85336 16 H Niwa, J Miyazaki, and A G Smith (2000), “Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells,” Nat Genet., vol 24, no 4, pp 372–376 17 H F Gu, A Alvarsson, S Efendic, and K Brismar (2009), “SOX2 has gender-specific genetic effects on diabetic nephropathy in samples from patients with type diabetes mellitus in the GoKinD study.,” Gend Med., vol 6, no 4, pp 555–64 18 J A Thomson et al (1998), “Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.,” Science, vol 282, no 5391, pp 1145–7 19 J B GURDON (1962), “The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles.,” J Embryol Exp Morphol., vol 10, pp 622–40 20 J Balzeau, M R Menezes, and C S Hagan (2017), “The LIN28/let-7 Pathway in Cancer,” Cancer Front Genet, vol 8, p 31 21 J Chappell and S Dalton (2013), “Roles for MYC in the Establishment and Maintenance of Pluripotency,” Cold Spring Harb Perspect Med., vol 3, no 12, pp a014381–a014381 22 J Hanna et al (2009), “Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration,” Nature, vol 462, no 7273, pp 595–601 23 J Jin (2017), “Stem Cell Treatments,” JAMA, vol 317, no 3, p 330 24 J Nichols et al (1998), “Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.,” Cell, vol 95, no 3, pp 379–91 25 J Tsialikas and J Romer-Seibert (2015), “LIN28: roles and regulation in development and beyond,” 26 J Rathjen and P D Rathjen (2002), “Formation of Neural Precursor Cell Populations by Differentiation of Embryonic Stem Cells In Vitro,” Sci World J., vol 2, pp 690–700 27 J Fukuda, T Kaneko, M Egashira, and K Oshimi (1998), “Direct measurement of CD34+ blood stem cell absolute counts by flow cytometry.,” Stem Cells, vol 16, no 4, pp 294–300 28 J Yu et al (2007) “Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells,” Science (80- )., vol 318, no 5858, pp 1917– 1920 29 K D Rainsford and M W Whitehouse (1976), “Gastric mucus effusion elicited by oral copper compounds: potential anti-ulcer activity.,” Experientia, vol 32, no 9, pp 1172–3 30 K Takahashi et al (2007), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,” Cell, vol 131, no 5, pp 861–872 31 K Takahashi and S Yamanaka (2006), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,” Cell, vol 126, no 4, pp 663–676 32 K Takahashi et al (2007), “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,” Cell, vol 131, no 5, pp 861–872 33 K J Livak and T D Schmittgen (2001), “Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the C T Method,” METHODS, vol 25, pp 402–408 34 K Van Craenenbroeck, P Vanhoenacker, and G Haegeman (2000), “Episomal vectors for gene expression in mammalian cells,” Eur J Biochem., vol 267, no 18, pp 5665–5678 35 M L Lan et al (2012), “Characterizing the Radioresponse of Pluripotent and Multipotent Human Stem Cells,” PLoS One, vol 7, no 12, p e50048 36 M Scudellari (2016), “How iPS cells changed the world,” Nature, vol 534, no 7607, pp 310–312 37 M Arya, I S Shergill, M Williamson, L Gommersall, N Arya, and H R Patel (2005), “Basic principles of real-time quantitative PCR,” Expert Rev Mol Diagn., vol 5, no 2, pp 209–219 38 M Stevanovic, O Zuffardi, J Collignon, R Lovell-Badge, and P Goodfellow (1994), “The cDNA sequence and chromosomal location of the human SOX2 gene.,” Mamm Genome, vol 5, no 10, pp 640–2 39 M Maekawa and S Yamanaka (2011), “Glis1, a unique proreprogramming factor, may facilitate clinical applications of iPSC technology,” Cell Cycle, vol 10, no 21, pp 3613–3614 40 N Desai, P Rambhia, and A Gishto (2015), “Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems,” Reprod Biol Endocrinol., vol 13, no 1, p 41 L Carabet, P Rennie, and A Cherkasov (2018), “Therapeutic Inhibition of Myc in Cancer Structural Bases and Computer-Aided Drug Discovery” 42 N Yoshioka et al (2013), “Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA,” Cell Stem Cell, vol 13, no 2, pp 246– 254 43 P Reinhardt et al (2013), “Genetic correction of a LRRK2 mutation in human iPSCs links parkinsonian neurodegeneration to ERK-dependent changes in gene expression.,” Cell Stem Cell, vol 12, no 3, pp 354–67 44 R A Young (2011), “Control of the Embryonic Stem Cell State,” Cell, vol 144, no 6, pp 940–954 2011 45 S Yamanaka (2009), “A fresh look at iPS cells.,” Cell, vol 137, no 1, pp 13–7 46 S Fernandes, S Tembe, P Shinde, S Melinkeri, V Kale, and L Limaye (2018), “Establishment of human iPSC line NCCSi003-A from CD34 + cells of peripheral blood collected during apheresis of healthy donor from Indian ethnicity,” Stem Cell Res., vol 27, pp 1–4 47 T M Schlaeger et al (2015), “A comparison of non-integrating reprogramming methods,” Nat Biotechnol., vol 33, no 1, pp 58–63 48 V K Singh, M Kalsan, N Kumar, A Saini, and R Chandra (2015), “Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery,” Front Cell Dev Biol., vol 3, p 49 X Meng et al (2012), “Efficient reprogramming of human cord blood CD34+ cells into induced pluripotent stem cells with OCT4 and SOX2 alone.,” Mol Ther., vol 20, no 2, pp 408–16 50 Y I Yeom et al (1996), “Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells.,” Development, vol 122, no 3, pp 881–94, Mar 51 Y Mu, M Zhao, and G Su (2014), “Stem cell-based therapies for agerelated macular degeneration: current status and prospects.,” Int J Clin Exp Med., vol 7, no 11, pp 3843–52 52 Z Ye et al (2009), “Human-induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders.,” Blood, vol 114, no 27, pp 5473–80 Trang web 53.https://www.the-scientist.com/news-opinion/japan-approves-ips-celltherapy-trial-for-spinal-cord-injury-65484 54 https://cellculturedish.com/ten-years-of-induced-pluripotent-stem-cells-alook-back/ 55.https://www.stemcell.com/hematopoietic-stem-and-progenitor-cellslp.html 56.https://www.antibodies-online.com/resources/17/1247/what-is-flowcytometry-facs-analysis/ [Accessed: 18-Apr-2019] 57.https://www.thermofisher.com/vn/en/home/life-science/dna-rnapurification-analysis/genomic-dna 58.https://www.biocompare.com/Product-Reviews/40820-Qiagen-8217-sRNeasy-Mini-Kit/ [Accessed: 24-Apr-2019] 59 https://www.thermofisher.com/vn/en/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-basics-rna-isolation.html 60 https://toptipbio.com/ct-value-qpcr/ [Accessed: 30-May-2019] ... [23],[6] So sánh tế bào gốc phôi tế bào gốc vạn cảm ứng trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi tế bào gốc vạn cảm ứng Tế bào gốc vạn Tế bào gốc phôi Tế bào gốc vạn cảm ứng Nguồn thu... đề tài: BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG (iPSC) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Sinh... nêu trên, lựa chọn đề tài: ? ?Biểu hệ vector tái lập trình tế bào gốc tạo máu người nhằm tạo tế bào gốc vạn cảm ứng (iPSC) ” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Biểu thành cơng hệ vector tái