Đang tải... (xem toàn văn)
3+, 4+ chì mửc độ ngưng kết; - : không ngưng kết; ( ): khi có tác dụng của IgG s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epìdermidis SNC: Staphylococcus negative congulase s[r]
(1)TAP CHÍ KHO A H Ọ C ĐHQGHN, KHTN & CN T.xx, số 2PT-, 2004
Ú N G D Ụ N G IG G T R O N G N G H IÊ N c ứ u Đ Ặ C T ÍN H L E C T IN VÀ P H Â N L O Ạ I T Ụ C Ẩ U K H U Ẩ N
B ù i P h n g T h u ậ n
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N M đ ầ u
M ột tro n g n h ữ n g ứng dụng thự c tế láp globulin m iễn dịch IgG để tách nghiên cứu đặc tín h hợp c h ấ t sinh học n hư glycoprotein, đặc biệt lectin Nhờ vào k h ả n ăng gây ngưng k ế t k ế t tủ a chọn lọc, lectin đ ang sử dụng nhiều nghiên cứu t ế bào miễn dịch, để xác dịnh nhóm m áu [2,4,5] N hững k ế t q u ả nghiên cứu trước chúng tơi cho thấy IgG có tương tác với lectin từ sam biên m ột sô lectin thực vật T rong nghiên cứu này, xem xét ảnh hưởng IgG lên phản ứng gây ngưng kết tế bào vi khuẩn lectin, nhằm mở rộng kh ả n ăn g ứng dụng IgG lectin thực tế
Chi tụ cầu k h u ẩ n (Staphylococcus) bao gồm nhiều tác n h â n gây bệnh cho ngưòi động vật Thưòng chúng chia làm hai loại dựa k h ả n ă n g làm đông h u yết tương (phán ứng coagulase): loại dương tính, chủ yếu Staph, aureus (tụ cầu vàng) gây bệnh nhiều n h ất, loại ám tính lồi tụ cầu trắ n g (trong có Staph, negative coagulase (SNC) Staph epiderm idỉs) gây tác hại Tuy nhiên, cách ph ân chia khơng xác có gáy nhẩm lẫn Do vậy, việc tìm m ột phương thức nh ận biết nhanh, nhạy khác biệt b ản hai loài tụ cầu để phân loại chúng có ý nghĩa lớn thực tế N g u y ê n liệ u v p h n g p h p
N guyên liêu:
-Dịch chiết lectin thô chuẩn bị từ m ẫu thực v ậ t (hoa, quả, h ạt) bằn g dung dịch đệm PBS [2]
- Các chủng vi khuẩn Staphylococcus (do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp) nuôi cấy, xử lý, tạo huyền dịch điều chỉnh đến độ đục thích hợp ỏ bước sóng 540 nm m áy đo quang phổ
- Chê phẩm LgG h u yết tương (tách từ m áu người b ình thư òng T ru n g tâm huyết học v truyền m áu T ru n g ương cung cấp)
P hư n g p h p n g h iê n u
■ Xác đ ịnh k h ả n ăn g gây ngưng k ế t t ế bào vi k h u ẩ n lectin [1]:
- Sử dụng kỹ th u ậ t ELISA [3] để nghiên cứu tương tác IgG với lectin vi khuẩn K ế t q u ả , t h ả o l u ậ n
1- T ác d ụ n g c ủ a IgG lê n p h ả n ứ ng g â y n g n g k ế t t ế bào vi k h u ẩ n c ủ a lec tin a- H oạt tín h gã y ngưng kế t t ế bào vi kh u ẩ n lectin
Một sô lectin biểu kh ả n ăn g gây ngưng k ế t không trê n t ế bào hồng cầu, mà trê n t ế bào vi k h u ẩn Đặc tín h n ày có ứng dụng r ấ t q u a n trọ n g tro n g nghiên cứu miễn dịch v địn h loại vi sinh v ật [1,6] C húng sử dụng vi k h u ẩ n có ý nghía m ặt dịch tễ đan g q u an tâ m sáu chủng tụ cầu vàn g Staph, aureus (S au) 4, 15, 16, 17, 25923 29213,; bốn chủng tụ cầu trắ n g SNC 20 19, Staph, epiderm is (s ep) 21, Staph, xy lu su s (S xy) để nghiên cứu tương tác lectin - vi k h u ẩ n (kết h àn g trê n bảng 1) tác dụng IgG lên tương tác (kết ngoặc đơn hàng bảng 1)
(2)174 Bùi Phuơng Thuận Các số liệu th u cho thấy có khác biệt m ẫu biếu ho ạt tính lectin Các m ẫu từ đậu ván, đậu dải, đậu trạch lai, h t hoè, hoa kim cúc, củ lay ơn đểu tác dụng lẽn vi k h u ẩn (với số chủng bị ngưng k ết đa 10%) tu y có kh ả n ăn g gây ngưng kết hồng cầu m ạnh Ngược lại, m ẫu từ h t móng bị đỏ, h t gội tía củ m ã th ầy (có hoạt tín h gây ngưng k ế t hồng cầu r ấ t th ấp ) lại tác d ụ n g lẽn h ầ u h ế t (từ 80- 100%) sô chủng tụ cầu th nghiệm
Một sô lectin có tác dụng liên k ế t chọn lọc với tụ cầu vàng, điển h ình )à lectin từ h t dậu ván (với chủng s au 17), h t đ ậu ngự (với mức độ ngưng k ế t khác b iệt rõ rệ t giảm dần chủng đầu: từ (3+) với s a u đến (+) với s a u 25923), h t n h ã n Ngược lại, số lectin khác l i gây ngưng k ế t r ấ t đặc hiệu chủng tụ cầu trán g , ví d ụ n h lectin từ hoa, đặc biệt rõ chê phẩm lectin vô hoè với mức độ ngưng k ết giảm dần từ (4+) với s.ep 21 xuống (2+) với S N C 19 (+) với s xy , hay n h lectin h t hoè có tác dụng p hân loại đặc hiệu hẹp gây ngưng k ế t tối đa (4+) n h ấ t ch ủ n g s x y Do vậy, có th ể sử dụng nhũng lectin dể p hân b iệt h a i lồi tụ cầu, th ậ m chí ch ủ n g từ ng loài
B ả n g Tác dụng IgG lên h o ạt độ gây ngưng k ế t t ế bào tụ cầu lectin TT
Lectin (OD)90nm ELISA với IgG)
Tu cầu vàng Tu cầu trắng
s.au
4 S.au15 s.au16 s.au 17 29213s.au 25923s au SNC19 SNC 20 s.ep21 s.xy
1 Hat dánh dành + + +
(0,039) (•) (*) (-) (+) (-) (*) (-> (’) (-) (+)
2 Hat đâu vàn 2+
(0.044) <-) (') (-) (-) (-) (•) (•) (•) (■) (•)
3 Hat dàu dái
(0) (-) (-) (2+) (*) {-) (•) (•) (•) (-) H
4 Hat dâu ngư 3+ 2+ 2+ + +
(0,050) (+> (-) (-> (-) (+) (-) (-) (-) (•) (-)
5 Hat đàu trach lai +
(Ĩ,131) (•) (•) (-) (■> (-) (+) (■) (•) (-> (-)
6 vỏhoè ♦ + +
(0,030) (+) (•) (■) (-) (•) (+) <•) (■) (•) H
7 Vò hoè (chế phầm) 2+ 4+ +
(0,078) (♦) (•) (-) {") (•) (•) (+) (■) {-) (+)
8 Hoa hoè + 2+
(0,068) (•) (-) (-) (•) (*) (•) (-) (■) (-) (-)
9 Hat hoè 4+
(0,032) (") (-> (-) (*) (-) (•) (-) (-) (•) (3+)
10 Cù lay ơn +
(0) (-) (+) (-) (-) (+) (■) (■) (*) (■) (-)
11 Hat gòi (ia 4+ 4+ 4+ 4+ 2* 4+ 3+ 4+
(0,269) <♦) (♦) (-) (•) (-) (-) (2+) (*) (■) (-)
12 Củ mả [háy 2+ + 2+ 4+ 3+ 2+ 2+ 3+ 3+ 4+
(0,095) (2+) (+) (2+) (+) (3+) {♦) (2+) {*) (-) (2+)
13 Hạl móng bổ dỏ 2+ 3+ + 2+ + * 2+ 2+
(4+) (2+) (*) (2+) (3+) H (+) (•) (•) (2+)
14 Hạt nhản + 2+
(+) W H ('-) (2+) (•) (-) (-) (-) (■)
15 Hal vải + + + + 2+
(o!ũ49) (2+) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (-) (") (2+)
16 Huyết sam + 2* + + 2+ 3+ +
(0,962) <♦) (+) (■) (2+) (3+) {-) <■) W (-) (+)
(3)I Sig dung lg(i Irong nphign cứu dặc lính lectin vã 175
Sự khác n hau h o t tín h gáy ngưng kết tẽ bào vi k h u ẩn loại lectin cho thấy có không n h ấ t vể th ụ th ể (các đường - tru n g tám tương tác với lectin), th n h phần kiểu liên k ế t củ a th ụ thể với gốc oligosaccharide polypeptide có bê m ặt chủng Staphylococcus. Chính có khả n ăng n hận b iết sai khác mà lectin trớ th àn h m ột công cụ đắc lực n hận dạng định loại vi sinh vật, th ay th ế cho phương pháp phân loại phức tạ p tốn thưòng dùng [1,6]
b-Tác d ụ n g IgG
B củng cho th IgG có tác dụng khác n h a u lên p hản ứng ngưng k ế t lectin với tế bào lụ cầu T rong 21% trường hợp, hoạt độ gáy ngưng k ế t lectin lên tê bào tụ cầu bị giám, cho thấy có tá c dụng ức chẽ IgG (so vái 75% sô m ẫu bị ức chê hoạt độ gây ngưng kết hồng cầu) H iện tượng tru n g tâm liên k ế t saccharide lectin bị IgG phong toả nên khõng tiệp'xúc với trung tâm tương tác với lectin bể m ặt tế bào dần đến m ất kh ả n ăng gâỹ-ĩigưng kết t ế bào
Điểu lý th ú IgG làm tán g phản ứng ngưng k ế t lectin vối m ột sơ chủng tụ cầu vàng, trưịng.hợp lectin từ h t móng bị đỏ với chủng s a u 4, 29213 17, h u y ết th anh sam với s a u 29213 17, m ẫu h t vải vối s a u Đặc biệt, lectin từ số m ầu chi biếu khả n ăng gãv ngưng k ế t tê bào tụ cầu vàng có IgG: m ẫu h t dành d ành với s a u 17, m ẫu đ ậu dải vói s a u 16, m ẫu củ lay ơn với s a u 15 29213 .H iện tượng khơng th có chủng tụ cầu trắng, khác với th nghiệm trẽn hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu với ch ấ t ức chế thông thường (như loại đường đơn) Do vậy, có thê sử dụng IgG phơi hợp với m ột số lectin để n h ận dạng chủng tụ cầu vàng Đồng thời điều gợi rằ n g phải chảng IgG tự có k h ả năn g gây ngưng kết tẽ bào tụ cầu vàng? Đê khảng đ ịnh giá th iết này, tiến h n h khảo s t khả nảng lương tác IgG t ế bào vi k h u ẩ n bằn g ELISA kỹ th u ậ t r ấ t n hạy chịu ản h hưdng yếu tô chủ quan
2- N g h iê n u tư ng tá c củ a IgG với lec tin vi k h u ẩ n b a n g k ỹ t h u ậ t E L ISA a ■ Tương tác IgG-lectin
Sô' đo độ h ấp th u q u an g (OD490nm) bảng (ỏ phía tên lectin) biểu th ị mức độ b ắ t giữ k h án g th ể IgG m ẫu lectin sử dụng làm k h án g nguyên gắn bàn Tác dụng m ạnh n h ấ t m ẫu h u yết th an h sam (OD = 0,921), m ẫu h t gội tía (OD = 0,269), đậu trạc h lai (OD = 0,131) m ẫu h t đậu dải củ lay ơn không nh ận b iết IgG Có th ể th tương đồng k ết q u ả với tác dụng ức chế IgG lên tương tác lectin - tụ cầu M ẫu h t gội tía có mức b ắ t giũ IgG cao n h ấ t (vối OD = 0,269), đồng thịi có k h ả n ă n g ngưng k ế t nhiều chủng tụ cầu n h ấ t (8/10), sơ' p hản ứng tương tác lectin -tụ cầu chịu tác dụng kìm hãm m ạnh n h ấ t IgG (phản ứng ngưng kết giảm từ 4+ x'ng (+) chí (-)) Tương tự vặy kết m ẫu mă th ầy với s a u 17 25923, huyết th a n h sam với S C N 20 s.ep
(4)176 Bùi Phưcmg Thuạn Tiếp theo, để nghiên cứu tác dụng trự c tiếp IgG lên t ế bào tụ cầu, đ ã cài tiến kỹ th u ậ t ELISA b ăng cách sử dụng vi k h u ẩn n ày làm k h n g nguyên gắn
B ả n g Tương tác IgG - tụ cầu xét nghiệm ELISA (OD.ig0nm )
T u c ầ vàng Tu c ầ u trắ n g
IgG s au
4
s a u 15 S a u l6 s au 17
s a u 25923
s a u 29213
SNC 19
SNC s.ep
20 21
s.xy
Chẻ phẩm 0,804 1,096 0,758 0,592 0,650 1,028 0,072 0,087 0,122 0,055
Huyết tương 0,848 0,836 0,446 0,800 1,086 0,632 0,028 0,060 0,027 0/138 Ghi chú: s.au: Staphylococcus aureus s.ep: Staphylococcus epidermidis
SNC: Staphylococcus negative congulase s.xy: Staphylococcus xylusus SỐ liệu trê n bảng cho th có khốc b iệt rõ rà n g hai loài tụ cầu th nghiệm Các chủng tụ cầu vàng b giữ r ấ t tốt IgG: kết cao n h ấ t Sta p h , aureus lõ (OD = 1,069), th ấp n h ấ t Staph, aureus 17 (OD = 0,592) T rong đó, vói tụ cầu trắn g chí có Staph E p iderm idis kết hợp với IgG ỏ m ức độ th ấ p nhiều (OD = 0,112), chủng lại tác dụng r ấ t yếu Các k ết so s n h th u dược SÜ dụng huyết tương người (với tồn lóp Ig protein tạp khác) làm k h án g th ể tương đồng, chí cịn cho th khác b iệt rõ rệ t h lồi tụ cầu, đơn giản nhiều không cần phải tin h ch ế IgG Nguyên n hân sai khác hai loài tụ cầu có th ể protein A (m ột k h án g nguyên bề m ặt đặc trứ ng th n h t ế bào tụ cẩu vàng có k năn g k ế t hợp với vùng Fc IgG) có trê n bể m ặt Sta p h , aureus n h ặ n biết liên kết với IgG Vặy giả th iế t tương tác trự c tiếp giũa IgG với chủng tụ cầu vàng nghiên cứu k h ăn g định Đồng thời có th ể r ú t k ế t lu ận tụ cầu trắn g không tác d ụ n g với IgG, nên trê n bề m ặt chúng kh ơng có protein A K ết luận phù hợp vái k ế t nghiên cứu điều tra protein A ỏ ch ủ n g tụ cẩu trắ n g mà tiến hành
Kếl th nghiệm cịn cho th ấ y có th ể dựa vào mức độ tương tá c tê bào tụ cầu trực tiếp gắn kỹ th u ậ t ELISA cải tiến vổi IgG đê p hân b iệ t hai loài tụ cầu vàng trắn g , để phản b iệt chủng khác n h a u tụ c ầ u vàng Bên cạnh dó, việc nghiên cứu ản h hư âng IgG đến ho ạt tính gây ngưng k ế t t ế bào vi khuẩn lectin kỹ th u ậ t k ế t tủ a m iễn dịch kỹ th u ậ t ELISA đ ã cho n h ữ ng k ế t tương dồng Điểu cho th kỹ th u ậ t m iễn dịch đơn giản n h ng hoàn toàn đán g tin cậy, rấ t phù hợp cho nghiên cửu đặc tín h lectin (như tương tác lectin- IgG- vi khuẩn), n h ấ t điều kiện tra n g th iết bị h n chê n h ỏ Việt nam
K ế t lu ậ n
IgG có khả năn g kìm hãm ho ạt độ 72% số m ẫu lectin p h ả n ù ng gây ngưng kết hồng cầu 21% sô m ẫu ph ản ứng gây ngưng k ế t tụ cầu
(5)So với kỹ th u ậ t ELISA, kỹ th u ậ t kết tủ a miễn dịch đ t độ xác tương đương, đơn gián đõ tốn hơn, th u ậ n tiện cho nghiên cứu đặc tính lectin (như tương tác lectin -(IgG)- vi khuẩn)
T À I L IỆ U TH A M K H Ả O
1 Doyle R.J., Introduction to lectin and their interaction with microorganisms Lectin -microorganism interactions (eds Doyle R.J and Slifkin M M ), Marcel Dekker Publisher, Inc, New York, 1994
2 Goldstein I.J., & Poretz R D., Isolation and chemical properties of lectins The lectins: properties, functions, and applications in biology and medecine (eds Liener E., Sharon N and Goldstein I.J.) Academic Press, Orlando, 1986
3 Engvall E., Perlm ann p., Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA), Quantitative assay of immunoglobulin G"- Immunochemistry, New York, 1971, pp 871- 873 Kilpatrick D c , Handbook o f anim al lectins: properties and biomedical applications, John
Wiley & sons Publisher, LTD, New York, 2000
5 Peum ans w J and Van Damme E J M., Lectins as plant defense proteins, Plant Physiology, New York, 109, 1995, pp 347- 352
6 Slifkin M., Application of lectin in clinical bacteriology, Lectin ■ microorganism interactions, (eds Doyle R.J and Shfkin M M.) Marcel Dekker Publisher, Inc, New York, 1994
VNU JOURNAL OF SCIENCE N at S ci & Tech T XX Np2AP, 2004
ủhg dung IgO tmnÿ n g 111C II cứu tlàc lính leclin vã 177
S T U D Y O N T H E IG G E F F E C T S O N L E C T I N A C T I V I T Y A N D T H E S T A P H Y L O C O C C U S I D E N T I F I C A T I O N
B u i P h u o n g T h u a n D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
The study revealed th a t 21% vegetal lectin sam ples with Staphylococcus a gglutinating activity are inhibited by IgG, compare w ith 72% for th e hum an red blood cells a gglutinating activity Beside th e modified ELISA assay (using directly bacteria to coat the p late wells), th e lectins w ith proper specificities an d IgG can be used (separately or combined w ith each other) for th e recognition of Staphylococcus aureus Strains, based on th eir ability to ag g lu tin ate selectively cells