Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thành phần aglycon của loài huệ (polianthes tuberosa l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– NGUYỄN HỮU PHONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON CỦA LOÀI HUỆ (Polianthes tuberosa L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– NGUYỄN HỮU PHONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON CỦA LOÀI HUỆ (Polianthes tuberosa L.) Chuyên ngành: Hoá hữu Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VĂN KHANG THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả NGUYỄN HỮU PHONG Xác nhận Khoa chuyên môn Xác nhận Người hướng dẫn khoa học TS PHẠM VĂN KHANG Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành phịng thí nghiệm Hố hữu trường Đại học sư phạm Thái Nguyên Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Văn Khang Người thầy tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy khoa Hố - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, thầy cô tận tình giảng dạy, giúp đỡ đưa nhiều ý kiến quý báu mặt chuyên môn q trình tơi nghiên cứu hồn thành luận văn Đồng thời xin chân thành cảm ơn cử nhân Đào Mai Phương Doãn Thị Chinh giúp đỡ cá nhân tơi q trình thực nghiệm Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn Thái nguyên, tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Hữu Phong Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ii http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình, sơ đồ vi Lời cam đoan iii MỞ ĐẦU 1 Lý cho ̣n đề tài Mu ̣c tiêu của đề tài Nô ̣i dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Dự kiế n kế t quả đa ̣t đươ ̣c Dự kiế n cấ u trúc luâ ̣n văn Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát thực vật họ Thùa (Agavaceae) 1.1.1 Giới thiệu họ Thùa 1.1.2 Giới thiệu chi Huệ (Polianthes) 1.2 Giới thiệu loài Huệ 1.2.1 Tên khoa học 1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố tự nhiên 1.2.3 Kinh nghiệm sử dụng y học dân gian 10 1.3 Tổng quan nghiên cứu hoá học thực vật Huệ 10 1.3.1 Hợp chất saponin 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu thành phần tinh dầu hoa Huệ 15 1.4 Tổng quan nghiên cứu hoạt tính sinh học 18 1.4.1 Hoạt tính hợp chất saponin 18 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iii http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.4.2 Hoạt tính cơng dụng tinh dầu Hoa huệ 19 Chương 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Hóa chất - dụng cụ 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Dụng cụ 21 2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách xác định cấu trúc chất phân lập 21 2.3.1 Xử lý mẫu thưc vật 21 2.3.2 Chiết xuất dược liệu 22 2.3.3 Thủy phân mẫu axit 22 2.3.4 Phương pháp định tính dịch chiết CHCl3 22 2.3.5 Phân lập chất từ dịch chiết Huệ 24 2.3.6 Xác định cấu trúc chất 24 2.3.7 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 24 2.4 Phương pháp xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ 25 2.5 Thực nghiệm 25 2.5.1 Chiết xuất xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ 25 2.5.2 Phân lập chất loài Huệ 26 2.5.3 Dữ liệu phổ chất phân lập 30 2.5.4 Thực nghiệm GC/MS 33 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết định tính nhóm hợp chất cao chiết CHCl3 34 3.2 Kết phân lập hợp chất 35 3.3 Xác định cấu trúc chất phân lập 35 3.3.1 Xác định cấu trúc chất 35 3.3.2 Xác định cấu trúc chất 38 3.3.3 Xác định cấu trúc chất 41 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.4 Kết phân tích thành phần tinh dầu từ hoa Huệ 46 3.5 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 49 3.5.1 Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định nuôi cấy 49 3.5.2 Qui trình thử nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 49 3.5.3 Kết kháng vi sinh vật kiểm định 50 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT H-NMR: 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 GC-MS: Sắc ký khí khối phổ HMBC: Phổ hai chiều( tương tác xa) Tế bào A549: Tế bào ung thư phổi SKLM: Sắc kí lớp mỏng MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu IC50 : Nồng độ ức chế 50% MBC: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MMP-2: Gen nằm nhiễm sắc thể 16 Hl-60: Dòng tế bào ung thư máu người MDA-MB-231: Dòng tế bào ung thư vú người LC-MS: Sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ HT-29: Ung thư tuyến đại tràng ERK1/2: Các protein ERK1/2 tham gia phân chia tế bào HSC: Tế bào gốc sinh dòng tế bào máu tế bào miễn dịch Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần chất nước ép hoa Huệ 16 Bảng 1.2: Thành phần hóa học dịch chiết n-Hexan 17 Bảng 2.1: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR 30 Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H, 13C-NMR 31 Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H, 13C-NMR 32 Bảng 3.1: Kết định tính số nhóm chất hữu có cao chiết CHCl3 34 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất tham khảo 36 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR chất hợp chất tham khảo 39 Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR chất hợp chất tham khảo 42 Bảng 3.5 Thành phần hóa học tinh dầu lồi Huệ 48 Bảng 3.6: Kết kháng vi sinh vật kiểm định chất 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ẢNH Hình 1.1 Sắc ký đồ GC nước ép hoa Huệ[14] 15 Hình 1.2 Sắc ký GC dịch chiết n-hexan hoa Huệ [14] 16 Hình 3.1 Phổ 1H-NMR chất 37 Hình 3.2 Phổ 13C-NMR chất 38 Hình 3.3 Cấu trúc stigmasterol 38 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR chất 40 Hình 3.5 Phổ 13C-NMR chất 41 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học chất 41 Hình 3.7 Phổ 1H-NMR chất 43 Hình 3.8 Phổ 13C -NMR chất 44 Hình 3.9 Phổ 13C -NMR chất 44 Hình 3.10 Cấu trúc Tigogenin 45 Hình 3.11 Phổ HMBC chất 45 Hình 3.12 Phổ HMBC chất 46 Hình 3.13 Phổ GC/MS tinh dầu Hoa huệ 47 Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu tinh dầu Hoa huệ 25 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết thủy phân dược liệu 27 Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập chất cặn chiết clorofom lồi hoa Huệ 29 Ảnh 1.1 Hình ảnh lồi Huệ Ảnh 1.2 Củ rễ loài Huệ Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN vi http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.5 Thành phần hóa học tinh dầu loài hoa Huệ Thời gian lưu Tên hợp chất % (min) 17.404 Benzeneacetaldehyde 2.32 18.204 1,8-Cineole 0.33 Thời gian Tên hợp chất lưu (min) % 29.402 Isoeugenol 10.19 29.739 3,4- 0.34 Dimethoxybenzaldehyde 18.428 Methylbenzoate 0.35 29.977 Methylisoeugenol 0.46 19.166 Nonanal 0.54 30.067 Ecosanol 1.38 19.968 5-Octadecene 6.76 30.425 Tricosane 0.97 20.275 (E)-Citral 0.15 30.503 α-Farnesene 2.28 21.438 Dodecane 0.34 30.776 trans-Farnesol 4.52 21.552 1-Icosene 9.56 31.195 Heneicosane 1.79 21.796 Decanal 0.59 31.361 Benzylbenzoate 6.04 23.083 1-Nonadecene 5.12 31.570 (Z)-nerolidol 3.16 24.169 2-Ethylhexylacrylate 0.48 31.685 Phenylethylbenzoate 0.62 25.300 Geraniol 3.40 32.014 2-heptadecanone 1.38 26.040 Geranylacetate 2.19 32.270 Diisobutylphthalate 5.80 26.228 Tetradecane 0.37 33.702 Pentacosane 0.52 26.660 Indole 7.02 33.744 Tetradecanol 0.10 27.352 Methyl2-aminobenzoate 11.06 34.423 Benzylsalicylate 3.07 27.693 Geranial 0.53 35.314 Hexadecanol 0.50 27.954 Eugenol 3.90 35.362 Heptacosane 0.13 29.064 Methyleugenol 0.50 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 48 http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.5 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 3.5.1 Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định nuôi cấy - Các chủng vi sinh vật: mua ngân hàng ATCC gồm Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis ATCC 27212 Staphylococcus aureus ATCC 12222 Lactobacillus fermentum ATCC 14931 Vi khuẩn Gr (-) : Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 Salmonella enterica ATCC 14028 Nấm : Candida albican - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mơi trường trì bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)Sigma cho nấm men nấm mốc Vi khuẩn môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma Mơi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm 3.5.2 Qui trình thử nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Đây phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu mẫu thử thông qua giá trị thể hoạt tính MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) a Pha loãng mẫu thử: - Mẫu ban đầu pha lỗng DMSO nước cất vơ trùng thành dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu mục đích thử Nồng độ thử cao 256 g/ml, 32 g/ml, g/ml, g/ml, 0,5 g/ml Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 49 http://www.lrc.tnu.edu.vn b Thử hoạt tính Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn nấm với nồng độ 5.10 CFU/ml tiến hành thử - Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo nồng độ pha loãng, thêm 200 l dung dịch vi khuẩn nấm, ủ 37oC Sau 24h, đọc giá trị MIC mắt thường Giá trị MIC xác định giếng có nồng độ chất thử thấp gây ức chế hoàn toàn phát triển vi sinh vật Giá trị IC50 tính tốn dựa số liệu đo độ đục tế bào máy quang phổ TECAN phần mềm raw data c Chất tham khảo - Kháng sinh Ampicillin cho chủng vi khuẩn Gram (+) chủng E.c với giá trị IC50 khoảng 0.05-2g/ml - Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pseudomonas aeruginosa với giá trị IC50 khoảng 4-5 µg/ml - Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 khoảng 0,5-1 g/ml 3.5.3 Kết kháng vi sinh vật kiểm định Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo tính xác thí nghiệm liệu Kết thu thể bảng 3.6 Bảng 3.6: Kết kháng vi sinh vật kiểm định chất Giá trị IC50 chủng (g/ml) TT Tên mẫu Gram (+) Nấm Gram (-) Staphylococ cus aureus Bacillus subtilis Lactobacill us fermentum Salmonell a enterica Escherich ia coli Pseudomon asaerugino sa Candida albican > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Nhận xét: Với kết thu bảng trên, ta nhận thấy hai chất khơng thể hoạt tính kháng ví sinh vật kiểm định nồng độ nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 50 http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN 1- Từ phần thân loài Huệ (Polianthes tuberosa) thu hái Phú Lương - tỉnh Thái Nguyên; phân lập xác định cấu trúc hóa học 03 chất cặn CHCl3 dịch thủy phân cao chiết cồn 90% lồi Cấu trúc hóa học chất xác định liệu phổ 1D 2D NMR so sánh với tài liệu tham khảo, chất xác định là: - Chất 1: Stigmasterol - Chất 2: β-Sitosterol - Chất 3: Tigogenin 2- Hai chất tiến hành đánh giá hoạt tính kháng ví sinh vật kiểm định khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu Cả ba hợp chất aglycon phân lập lồi có vai trò dẫn chất tổng hợp hữu dược chất sử dụng rộng rãi y học 3- Từ hoa lồi Huệ chúng tơi tiến hành chiết xuất tinh dầu xác định thành phần hóa học, hàm lượng chất có phương pháp GC(FID)/MS Kết xác định 37 thành phần hóa học hàm lượng chúng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 51 http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Đỗ Tất Lợi, (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà XB Y học II Tài liệu tiếng anh A.P Rajput and T.A Rajput, (2012), “Isolation of Stigmasterol and βSitosterol from Chloroform Extract of Leaves of Corchorus fascicularis Lam”, International Journal of Biological Chemistry, 6: 130-135 Firdous S, Khan K.M, Ahmad V.U, Usmani S.B, Ahmed M, Rashid A, (1999), “A new glycoside from Polianthes tuberosa”, Fitoterapia, 70, 203204.[15] Firdous, S.; Rashid, A.; Ahmad, V U.; Khan, K M.; Usmani, S B, (1999), “A novel steroidal saponin from Polianthes tuberosa L.” B Nat Prod Lett, 14, 115-122 Firdous, S.; Khan, K M.; Ahmad, V U.; Usmani, S B.; Ahmed, M.; Rashid, A., (1999), “ A new glicoside from Polianthes tuberosa” Fitoterapia, 70, 203-204 George R Pettit; Moser, B R.; Mendonç a, R F.; Knight, J C.; Hogan, F, (2012), “The Cephalostatins 23 Conversion of Hecogenin to a Steroidal 1,6-Dioxaspiro[5.5]nonane Analogue for Cephalostatin 11” J Nat Prod, 78, 1067–1072 Jian-Ming Jin, Ying-Jun Zhang, Chong-Ren Yang, (2004), “Spirostanol and Furostanol Glycosides from the Fresh Tubers of Polianthes tuberosa”, J Nat Prod, 67, 5-9 Juciano Gasparotto, Nauana Somensi, Alice Kunzler, Carolina Saibro Girardi, Matheus Augusto de Bittencourt Pasquali, Vitor Miranda Ramos, Andre Simoes-Pires, Lucindo Jose Quintans-Junior, Alexsandro Branco, Jose Claudio Fonseca Moreira and Daniel Pens Gelain, (2015), “Hecogenin Acetate Inhibits Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 52 http://www.lrc.tnu.edu.vn Reactive Oxygen Species Production and Induces Cell Cycle Arrest and Senescence in the A549 Human Lung Cancer Cell Line” Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 14, 1128-1135 Kelly Barbosa Gama, Jullyana S S Quintans, Angelo R Antoniolli, Lucindo J Quintans-Jú nior, Wagno Alca ntara Santana, Alexsandro Branco, Milena Botelho Pereira Soares, and Cristiane Flora Villarreal, (2013) “Evidence for the Involvement of Descending Pain-Inhibitory Mechanisms in the Antinociceptive Effect of Hecogenin Acetate”, J Nat Prod, 76, 559−563 10 Lai-King Sy, Chun-Nam Lok, Juan-Yu Wang, Yungen Liu, Lu Cheng, PuiKi Wan, Chi-Ting Leung, Bei Cao, Wai-Lun Kwong, Raymond ChuenChungChang Chi-Ming Che, (2016), “Identification of “sarsasapogeninaglyconed” timosaponins as novel Ab-lowering modulators ofamyloid precursor protein processing”, Chemical science : DOI: 10.1039/c5sc02377g 11 Prapassorn Rakthaworn 1, Uraiwan Dilokkunanant 1,Udomlak Sukkatta, Srunya Vajrodaya, Vichai Haruethaitanasan, Potechaman Pitpiangchan, Putthita Punjee, (2009), “Extraction Methods for Tuberose Oil and Their Chemical Components” Kasetsart J (Nat Sci.) 43, 204 - 211 12 Rashid, A.; Firdous, S.; Ahmad, V U.; Khan, K M.; Usmani, S B., Ahmed, M.Pak J., (1999) “A new glycoside from Polianthes tuberosa”, Sci Ind Res, 42, 26 13 Wahba, H E.; Hashem, F A.; Saleh, M M, (1998), “ Analysis of tuberese volateles by head-space enrichment on tenax and their sub-acute dermal toxicity test”, Egypt J Pharm, 39, 435-441 14 Yoshihiro Mimaki, Akihito Yokosuka, and Yutaka Sashida, (2000), “Steroidal Glycosides from the Aerial Parts of Polianthes tuberosa”, J Nat Prod, 63, 1519-1523 15 Yoshihiro Mimaki, Akihito Yokosuka, Chiseko Sakuma, Hiroshi Sakagami, and Yutaka Sashida, (2002), “Spirostanol Pentaglycosides from the Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 53 http://www.lrc.tnu.edu.vn Underground Parts of Polianthes tuberosa”, J Nat Prod, 65, 1424-1428.[16] 16 Zhong Hua Ben Cao, (1999), “State Administration of Traditional Chinese Medicine (SATCM)”, Shanghai Scientific and Technological Press: Shanghai, ; Vol 8, pp 213-214 17 Zhou, J.; Wu, D.-G.; Huang, W.-G.Acta Pharm, (1965), “Steroidal sapogenins from the plan in yunnan province”, 12, 392-397 18 Boll PM, & v Philipsborn W (1965) “Studies and the absolute configuration of Solanum alkaloids” Acta Chem Scand 19, 1365-1370 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 54 http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC Hình S1 Phổ 1H-NMR chất Hình S2 Phổ 1H-NMR chất Hình S3 Phổ 13C-NMR chất Hình S4 Phổ 13C-NMR chất Hình S5 Phổ HMBC chất Hình S6 Phổ HMBC chất Hình S7: Thực nghiệm thử hoạt tính sinh học chất 2,3 Hình S8: Thực nghiệm thử hoạt tính sinh học chất 2,3 (tiếp) Hình S9: Thực nghiệm thử hoạt tính sinh học chất 2,3 (tiếp) Hình S10: Thực nghiệm GC (FID)/MS dịch chiết n-hexan Hình S11: Thực nghiệm GC (FID)/MS dịch chiết n-hexan ... PHONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON CỦA LOÀI HUỆ (Polianthes tuberosa L. ) Chuyên ngành: Hoá hữu Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VĂN KHANG... diribo-furanosyl ethyleneglycol [7] phân l? ??p từ phận mặt đất loài Một số saponin gồm polianthosides B ( 9), C (1 0), bốn polianthosides DG (1 1)- (1 4), với tám saponin (1 5) đến (2 2) phân l? ??p từ củ tươi loài. .. Học liệu – ĐHTN 30 H NMR (ppm), J (Hz) 1.53-1.78 (m) 1.16-1.78 (m) 3.53 (m) 1.40-1.67 (m) 5.35 (br d, 3, 5) 1.40-1.95 (m) 1.78 (m) 1.76 (m) 1.56 (m); 1.67 (m) 1.55 (m); 1.65 (m) 2.03 (m) 0.84 (s)