INTENDED USE: The ZYMUTEST antiVIII, IgG, a qualitative or quantitative Monostrip ELISA kit, is a standardised and optimised enzyme immunoassay designed for measuring auto and alloantibodies to Factor VIII, of the IgG isotype, in human plasma or serum or in any biological fluid where autoantibodies to FVIII can be present.
ZYMUTEST Anti VIII IgG MonoStrip IgG - Isotype (# ARK039A) Complete ELISA kit for detection and quantification of antibodies to Factor VIII (FVIII), IgG isotype For in vitro research use only Last revision: 06/02/2012 INTENDED USE: REAGENTS PREPARATION, STORAGE AND STABILITY: The ZYMUTEST anti-VIII, IgG, a qualitative or quantitative Monostrip ELISA kit, is a standardised and optimised enzyme immuno-assay designed for measuring auto and allo-antibodies to Factor VIII, of the IgG isotype, in human plasma or serum or in any biological fluid where auto-antibodies to FVIII can be present In their original packaging box, before use, when stored at 2-8°C, the unopened reagents are stable until the expiration date printed on the box ASSAY PRINCIPLE: The diluted plasma sample or biological fluid is introduced into one of the microwells of the Recombinant FVIII coated strip When present, anti-VIII auto and allo-antibodies bind to immobilised FVIII Following a washing step, bound antibodies, of the IgG isotype, are revealed with a goat antihuman IgG (FcJ specific)-peroxidase conjugate, which reacts specifically with IgG isotypes Following a new washing step, the peroxidase substrate, Tetramethylbenzidine (TMB) in presence of hydrogen peroxide (H2O2), is introduced and a blue colour develops The colour turns yellow when the reaction is stopped with sulfuric acid The colour developed is directly proportional to the amount of anti-VIII antibodies, of the IgG isotype, present in the tested sample Micro ELISA plate: open the aluminium pouch and take off the strips Open as many pouches as needed well strips When out of the pouch, the strips must be used within 30 minutes Anti FVIII Sample Diluent: It is ready to use When open, it can be used for weeks, stored at 2-8°C, and provided that any bacterial contamination is avoided during use This reagent contains sodium azide Warning: The Anti FVIII Sample Diluent contains sodium azide, which may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides Flush with large volumes of water when discarding into a sink Positive control: restore each vial with 0.5 ml Anti FVIII Sample Diluent in order to obtain the ready to use positive control It corresponds to a plasma containing IgG isotype auto-antibodies to Factor VIII, already diluted 1:100 Following reconstitution, the positive control is stable for weeks at 2-8°C, provided any bacterial contamination is avoided during use Negative control: restore each vial with 0.5 ml Anti FVIII Sample Diluent in order to obtain the ready to use negative control It corresponds to a normal human plasma, already diluted 1:100 Following reconstitution, the negative control is stable for weeks at 2-8°C, provided any bacterial contamination is avoided during use TESTED SAMPLES: Trisodium citrate or Na2 EDTA anticoagulated human plasma or human serum Any biological fluid, where human auto-antibodies to FVIII, of the IgG isotype, must be assayed REAGENTS: COAT: strips of wells (Micro ELISA), coated with recombinant Factor VIII, human, saturated, then stabilized; each strip is individually packed in an aluminium pouch hermetically sealed in presence of a desiccant SD: vials containing 12 ml of Anti FVIII Sample Diluent, ready to use Contains Sodium Azide C+: vials of anti-FVIII, IgG, positive Control, lyophilised When restored with 0.5 ml of Autoimmunity Sample Diluent, the ready to use positive control is obtained (already diluted 1:100) Warning: Negative control is prepared with human plasma Any human plasma used is tested with registered methods and found negative for HIV antibodies, HBs Ag and HCV antibodies However, no assay may warrant the total absence of infectious agents Any product of human origin must then be handled with all the required cautions, as being potentially infectious Anti-IgG (FcJ)-HRP immunoconjugate: each vial must be restored with ml of Conjugate Diluent Let the pellet to be completely dissolved before use, and shake the vial gently in order to homogenize the content The restored conjugate is stable for at least 24 hours at room temperature or for at least weeks at 2-8°C C-: vials of negative control, lyophilised (diluted normal human plasma) When restored with 0.5 ml of Anti FVIII Sample Diluent, the ready to use negative control is obtained (already diluted 1:100) Conjugate Diluent: It is ready to use When open, it can be used for weeks, stored at 2-8 °C, and provided that any bacterial contamination is avoided during use This reagent contains 0.05% Kathon CG IC: vials of immunoconjugate (Anti-IgG (FcJJ)-HRP immunoconjugate), affinity purified goat antibodies specific for human IgG-FcJ coupled to HRP, lyophilised When restored with ml of Conjugate Diluent (CD), the ready to use immunoconjugate is obtained CD: vial of 10 ml of Conjugate Diluent, ready to use WS: vials of 12 ml of 20 fold concentrated Wash Solution Wash Solution: Incubate the vial for 15-30 minutes in a water bath, at 37°C, until complete dissolution of solids, when present Shake the vial and dilute the amount required 1:20 in distilled water (the 12 ml contained in the vial allow to prepare 240 ml of Wash Solution) The Wash Solution must be stored at 2-8°C in its original vial and used within weeks following opening The diluted Wash Solution must be used within days, when protected from any contamination This reagent contains 0.05% Kathon CG TMB: vial of 10 ml peroxidase substrate: 3,3',5,5' – Tetramethylbenzidine (TMB) containing hydrogen peroxide, ready to use TMB substrate: It is ready to use When open, it can be used for weeks, stored at 2-8°C, and provided that any bacterial contamination is avoided during use SA: One vial of ml of 0.45M Sulfuric acid (Stop Solution), ready to use Note: Use only components from a same kit lot Do not mix components from different lots of kits, when running the assay REAGENTS AND EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED: x Stop solution: It is ready to use Cautions: Sulfuric acid, although diluted to 0.45M is caustic As for any similar chemical, handle Sulfuric acid with great care Avoid any skin and eye contact Wear protection glasses and gloves when handling Note: Bring the kit at room temperature, at least 30 before use Store the unused reagents at 2-8°C The stability studies at 30°C show that the reagents can be shipped at room temperature without damage 8-channel or repeating pipette allowing dispensing 50-300 μl PROCEDURE: x 1-channel pipettes at variable volumes from to 20 μl, 20 to 200 μl and 200 to 1000 μl Sample collection: x Micro ELISA plate washing equipment and shaker x Micro ELISA plate reader with a wavelength set up at 450 nm x Distilled water Blood plasma (9 vol.) must be collected on 0.109 M citrate anticoagulant (1 vol.); plasma supernatant is decanted following a 15 centrifugation at 2,500 g; citrated plasma should be tested within 24 hours or stored frozen at –20°C or below for up to months, and thawed for 15 at 37°C just before use Thawed specimen must be tested within 12 hours EDTA collected human plasma may also be used Auto-antibodies to Factor VIII can also be assayed on serum Note: Refer to GEHT or NCCLS/CLSI recommendations for further instructions on specimen collection, handling and storage Discard any plasma presenting an unusual aspect (haemolysed, lipaemic aspect….) Tested plasma or sample or control: Plasma or serum is tested at 1:100 dilution in Anti FVIII Sample Diluent When high amounts of autoantibodies to Factor VIII are expected, samples must be assayed at 1:200 or 1:400 dilutions or higher Results must be corrected for the dilution factor Calibrator and negative control are ready to use (already diluted 1:100) D750-02/ZY/039A Assay procedure: Remove the strips from the aluminium pouches, for the series of measures to be performed Then put the strips in the frame provided In the different wells of the micro ELISA strips introduce the reagents and perform the various assay steps as indicated on the following table: Reagent Volume Anti- VIII IgG Positive control or Negative control 200 μl or 1:100 diluted sample or sample diluent (blank) Procedure Introduce the : Positive control or negative control or diluted sample or sample diluent into the micro ELISA plate wells Incubate for 60 minutes at room temperature (18-25 °C) (a) (b) Wash Solution (20 fold diluted in distilled water) 300 μl Proceed to successive washings using the washing instrument (b) Conjugate anti-IgG (FcJ)-HRP immunoconjugate, restored with ml of conjugate diluent 200 μl Immediately after the washing, Introduce the anti-IgG (FcJ)-HRP immunoconjugate in the micro ELISA plate wells Incubate for 60 minutes at room temperature (18-25 °C) (a) Wash Solution (20 fold diluted in distilled water) TMB/H2O2 Substrate 300 μl Proceed to successive washings using the washing instrument (b) 200 μl Immediately after the washing, introduce the substrate into the wells Nota: The substrate distribution, row by row, must be accurate and at exact time intervals (c) Let the colour develop for at room temperature (18-25 °C) (a) 0.45M Sulfuric Acid 50 μl Following exactly the same time intervals than for the addition of substrate, stop the colour development by introducing the 0.45M sulfuric acid ( c ) Wait for 10 minutes in order to allow the colour to stabilize and measure absorbance at 450 nm (A450) (d) Substract the blank value Note: a) b) c) d) Avoid letting the plate in the bright sunlight during incubations and more particularly during colour development A micro ELISA plate shaker can be used Never let the plates empty between the addition of the reagents or following the washing step The next reagent must be added within minutes, in order to prevent the plate from drying, which could damage the immobilized components If necessary, keep the plate filled with Wash Solution and empty it just before the introduction of the next reagent The washing instrument must be adjusted in order to wash the plates gently, and to avoid a too drastic emptying, which could lower plate reactivity For addition of the TMB substrate, the time interval between each row must be accurate and exactly determined It must be the same when stopping the reaction For bichromatic readings, a reference wavelength at 690 nm or at 620 nm can be used Positive control can be used as a calibrator in quantitative method Concentration of Positive control is determined in AU/mL and is specific to each lot The concentration of Positive control is indicated on the flyer provided with each lot The positive control is reconstituted with 0.5mL Sample diluent Standard solutions are obtained in the well by addition of 100μL of SD per well and by doing a serial two-step dilution of the control in Sample Diluent in the well, from 1:1 to 1:16 A concentration range from C:1 to C:16 is obtained Each well contain 100μL of each standard solution and 100μL of sample (100 fold diluted) is introduce in the well For C:16 dilution, remove 100μl after homogenization The other steps of the method are similar to the qualitative method Calibration curve: On a linear graph paper plot the factor anti-VIII antibody concentrations, in AU/ml, on abscissa and the corresponding absorbances (A450) on ordinates, in order to establish the “best fit” calibration curve Users must construct their own calibration curve, obtained using their standard dilutions From the curve obtained, deduce directly the factor anti-VIII antibody concentration for the tested sample For obtaining the factor anti-VIII antibody concentration in a sample tested at a higher dilution, this value must be multiplied by D:50 (i.e x2 for D=100 ) Alternatively, an ELISA software (i.e Dynex, Biolise, etc ) can be used for establishing the “best fit” curve and the calculation of concentrations QUALITY CONTROL: Controls provided in the kit allow validating the right performance of the assay Expected A450 values for positive and negative controls can present variations from lot to lot but, when the assay is run at room temperature, between 18 and 25°C, they always are: P = A450 for positive control t 1.0 Qualitative method: When the assay is run at 20r1°C, the results are as follows: Positive: A450 > 0.15 N = A450 for negative control: d 0.15 or d 12AU/mL Obtained values for P and N, at 20r1°C, are indicated on the flyer provided in the kit Obtained A450 can vary according to the effective temperature during the assay run Negative: A450d 0.15 Positive: > 24AU/ml 12 AU/ml>Grey zone > 24 AU/ml Negative d 12 AU/ml Note: When the room temperature is out of the recommended range, absorbance values can be affected The positive control can then be used for adjusting the cut-off value The flyer provided in the kit indicates the A450 value obtained for the positive control of the ZYMUTEST Anti VIII IgG lot used, and the value in % of this A450 corresponding to the cut-off The adjusted cut-off value is then the corresponding % of the absorbance measured for the positive control in your series of measurements LIMITATIONS OF THE ASSAY: If the washing step is not correctly performed, the negative control can produce a high absorbance value In order to avoid non-specific colour development, check that the washing step is performed efficiently As for any auto-antibody assay, clinical situation such as presence of inflammation, infectious diseases, auto-immune diseases, immun-complexes, presence of “sticky” IgG complexes, can induce a high background, which can be within the grey zone or in the weak positive range Check then for the possible presence of antibodies on another specimen collected later APPLICATIONS: / PATHOLOGICAL VARIATIONS: Hemophilia A is classically caused by a congenital deficiency of factor VIII, but acquired forms due to inhibitors to factor VIII (FVIII) can be observed, typically later in life Patients who develop such acquired factor VIII inhibitors may present with catastrophic bleeding episodes, despite having no prior history of a bleeding disorder Though the disorder is rare, it is known to cause significant morbidity and mortality Antibodies can neutralize FVIII (but not all of them) and can either be alloantibodies against exogenous FVIII or autoantibodies Factor VIII inhibitors are IgG alloantibodies that arise during replacement therapy in 25 to 50 percent of patients with severe haemophilia A The hydrolysis of factor VIII by anti Factor VIII antibodies has been proposed has a mechanism of inactivation of Factor VIII But the inhibitors can also occur in non-hemophiliac patients, although rare, in the setting of Idiopathic conditions - i.e otherwise normal elderly individuals Autoimmune disorders such as systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, etc Malignancies such as lymphoproliferative disorders, lymphomas, and solid tumors Drug reactions to penicillin, chloramphenicol, phenytoin, etc Pregnancy and the postpartum state Risk factors for development of antibodies: Severity of hemophilia: Patients with severe hemophilia are at a much higher risk because they are exposed to more FVIII therapy Age of the patient and degree of FVIII exposures: 15 -20% of heavily treated hemophiliac children develop antibodies by the age of 20 Genetic defect that results in the absence of synthesis of FVIII protein: These patients are at greater risk for developing antibodies after treatment with FVIII concentrates Characteristics of FVIII antibodies The majority of FVIII inhibitors are IgG antibodies, more specifically of the IgG4 subclass There are two main types of antibodies - Type I antibodies - seen in classic hemophiliacs FVIII inhibition follows linear kinetics - Type II antibodies - these are autoantibodies and they exhibit a more complex pattern of inhibition Antibodies are identified by their ability to neutralize FVIII at 37°C after incubation for 2-3 hours The ZYMUTEST anti- VIII, IgG Kit, specifically measures human autoantibodies to Factor VIII of the IgG isotype, reactive with immobilised recombinant Factor VIII, irrelevantly they are neutralizing or not IgM or IgA isotypes are not measured Difficulties in identifying the coexistence of neutralizing anti- VIII antibodies (anti-VIII) and lupus anticoagulant (LA) are mainly due to the interference of LA on anti-VIII assays We developed an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method that uses phospholipid-free recombinant factor VIII as the antigen Our aim was to reveal the presence of anti-VIII antibodies using a system that is not affected by LA The assay detects both neutralizing and non-neutralizing anti-VIII antibodies; therefore a neutralizing effect must be confirmed through functional tests ASSAY CHARACTERISTICS (QUANTITATIVE METHOD): - Results are expressed according to the A450 values, as positive or negative When higher dilutions are used, (i.e D), the complementary dilution factor must be considered Dynamic range: to about 300 AU/ml Detection threshold d AU/ml Intra-assay CV: 0.30 Quantitative method: When the assay is run at 20r1°C, the results are as follows: ASSAY SPECIFICITY AND CHARACTERISTICS: QUANTITATIVE METHOD: INTERPRETATION OF RESULTS: Alice D Ma and Daniel Carrizoza: Acquired Factor VIII inhibitors: Pathophysiology and treatment The American Society of Haematology 2006 Sallah S, Aledort L Treatment of patients with acquired inhibitors J Thromb Haemost 2005;3:595–597 Lavigne-Lissalde G, Schved JF, Granier C, Villard S Anti-factor VIII antibodies: a 2005 update Thromb Haemost 2005;94:760–769 Sebastien Lacroix-Desmazes, Jagadeesh Bayry; Namita Misra; Mickael P; and all: The prevalence of Proteolytic antibodies against factor VIII in Haemophilia A: new England of Medicine; vol 346, N°9, February 28, 2002 D.Söhngen, C Specker, and all: Acquired inhibitors to factor VIII in non-hemophilic patients Annals of Hematology, volume 74, Number 2/February 1997 Cohen AJ, Kessler CM Acquired inhibitors Baillieres Clin Haematol 1996; 9:331–354 D750-02/ZY/039A ZYMUTEST Anti VIII IgG MonoStrip IgG - Isotype (# ARK039A) Dosage ELISA de l’anticorps Anti Facteur VIII (FVIII), IgG isotype A usage de recherche in vitro exclusivement Dernière version : 06/02/2012 MÉTHODE : La trousse ZYMUTEST anti-VIII, IgG, Monostrip est un dosage quantitatif ou qualitatif de type ELISA sandwich pour la recherche et le dosage des auto- et allo-anticorps anti-VIII de type IgG, utilisable sur plasma humain ou sérum Précautions : Les réactifs contiennent de faibles quantités d'azide de sodium (NaN3) qui peuvent générer des composants explosifs au contact des canalisations en plomb ou en cuivre Pour éviter ce risque, effectuer des lavages intensifs PRINCIPE : La recherche des anticorps anti-VIII, avec le coffret ZYMUTEST anti-VIII, est réalisée l'aide de barettes ELISA, sensibilisées par du Facteur VIII recombinant, puis stabilisées Le plasma ou le sérum tester sont introduits dans l'un des puits des barettes sensibilisées Les auto et allo-anticorps anti-VIII de type IgG, quand ils sont présents, se fixent sur le Facteur VIII recombinant Après lavage, les anticorps ainsi fixés sont révélés par l'immunoconjugué, anticorps polyclonal de chèvre spécifique du fragment FcJ de l'IgG humaine et couplé la peroxydase (HRP) Cet immunoconjugué réagit spécifiquement avec l'auto-anticorps anti-VIII de type IgG Après lavage, le substrat, 3,3',5,5' – Tetramethylbenzidine (TMB) en présence d’eau oxygénée (H 2O2), est introduit dans les puits et une coloration bleue se développe L’arrêt de la réaction par l’acide sulfurique fait virer la coloration au jaune Cette coloration est proportionnelle la quantité d'anticorps anti-VIII de type IgG présente dans l’échantillon testé Après reconstitution, ce flacon peut être conservé 2-8°C, pendant semaines, en prenant soin d'éviter toute contamination lors de l'utilisation Plasma humain prélevé sur anticoagulant citraté ou Na EDTA ou sérum Tout autre liquide biologique où la recherche d'auto-anticorps et d’allo-anticorps anti-VIII de type IgG doit être effectuée Précautions : Le contrôle négatif est préparé avec des plasmas humains Ces derniers ont été testés par des méthodes enregistrées et sont certifiés exempts pour l'anticorps VIH, le Hbs Ag et l'anticorps VCH Toutefois, aucune méthode ne permettant d'exclure totalement le risque d'agent pathogène, ces produits doivent être manipulés avec toutes les précautions requises pour l'utilisation de produits potentiellement infectés COAT : barrettes de puits (MicroELisa), sensibilisées avec du Facteur VIII recombinant, stabilisées, et emballées individuellement dans un sachet aluminium en présence d'un déshydratant Anti-IgG (FcJ)-HRP immunoconjugate : Chaque flacon d'immunoconjugué doit être reconstitué par ml de "Conjugate Diluent" (CD) au moins 15 minutes avant utilisation Laisser la galette se dissoudre et agiter délicatement pour homogénéiser Après reconstitution, L'immunoconjugué est stable au moins 24 heures la température du laboratoire et semaines 2-8°C REACTIFS : Negative control (C-) : Chaque flacon doit être reconstitué avec 0.5 ml de diluant échantillon (SD) Le contrôle négatif ainsi reconstitué est prêt l'emploi et correspond un plasma négatif déjà dilué au 1/100 Après reconstitution, ce flacon peut être conservé 2-8°C, pendant semaines, en prenant soin d'éviter toute contamination lors de l'utilisation ECHANTILLONS : Positive Control (C+) : Chaque flacon doit être reconstitué avec 0.5 ml de diluant échantillon (SD) Le contrôle ainsi reconstitué est prêt l'emploi et correspond un plasma contenant des auto-anticorps anti-VIII d'isotype IgG, déjà dilué au 1/100 Conjugate Diluent (CD) : Le réactif est prêt l'emploi Après ouverture Après ouverture, il peut être conservé 2-8°C, pendant semaines, en prenant soin d'éviter toute contamination lors de l'utilisation Ce réactif contient 0.05% de Kathon CG SD : flacons de 12 ml de diluant échantillon pour tests auto-immuns (Anti FVIII Sample Diluent ), prêt l'emploi Contient de l’azide de sodium C+ : flacons de contrôle positifs lyophilisés (Anti-V,, ,,, IgG control) A reconstituer par 0.5 ml de diluant échantillon, afin d'obtenir le contrôle positif prêt l'emploi (déjà dilué au 1/100) Wash Solution (WS) : Incuber, si nécessaire, le flacon de solution de lavage dans un bainmarie 37°C jusqu'à dissolution totale des cristaux Agiter le flacon et diluer la solution de lavage au 1/20 en eau distillée Les 12 ml de solution concentrée permettent de préparer 240 ml de solution de lavage après dilution C- : flacons de contrôle négatif (Negative control), lyophilisés, contenant du plasma humain normal dilué Après reconstitution avec 0.5 ml de diluant échantillon, le contrôle négatif est prêt l'emploi (déjà dilué au 1/100) Après ouverture, le flacon est stable semaines 2-8°C, l'abri de toute contamination La solution de lavage diluée peut être utilisée jusqu'à jours après préparation, lorsqu'elle est protégée de toute contamination Ce réactif contient 0.05% de Kathon CG IC : flacons d'immunoconjugué (Anti-IgG (FcJ)-HRP immunoconjugate), anticorps polyclonal de chèvre, spécifique de la partie FcJ de l'IgG humaine, couplé la peroxydase et lyophilisé L’immunoconjugué prêt l’emploi est obtenu après reconstitution par ml de diluant pour immunoconjugué (CD) CD : flacon de 10 ml de diluant pour immunoconjugué (Conjugate Diluent), prêt l'emploi WS : flacons de 12 ml de solution de lavage (Wash Solution), 20 fois concentrée TMB : Un flacon de 10 ml de substrat : 3,3',5,5' – Tetramethylbenzidine (TMB), contenant de l’eau oxygénée, prêt l’emploi SA : Un flacon de 3ml d’acide sulfurique 0.45M (Stop Solution) (SA), prêt l’emploi Nota : Utiliser uniquement les réactifs provenant de coffrets d'un même lot Ne pas mélanger les réactifs provenant de différents lots de kits pour réaliser un dosage MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI : Substrat TMB: substrat prêt l’emploi Après ouverture, il peut être conservé 2-8°C, pendant semaines, en prenant soin d'éviter toute contamination lors de l'utilisation Solution d’arrêt (SA) : Solution contenant 0.45M d'acide sulfurique, prête l’emploi Précaution : Même dilué 0,45 M, l'acide sulfurique est caustique Comme pour tout réactif chimique semblable, manipuler l'acide sulfurique avec précaution, en particulier en utilisant des gants et en portant des lunettes de protection Eviter tout contact avec la peau et les yeux Nota : Sortir le coffret du réfrigérateur, au moins 30 avant le dosage, afin que les divers réactifs s'équilibrent température du laboratoire Conserver les réactifs inutilisés 2-8°C Les études de vieillissement, réalisées 30°C pendant semaines, montrent que les réactifs peuvent être expédiés température ambiante, sans aucun dommage MODE OPERATOIRE : Préparation de l'échantillon : PREPARATION, CONSERVATION ET STABILITE DES REACTIFS : Le sang (9 volumes) doit être collecté sur du citrate trisodique 0.109 M (1 volume) ; le plasma est obtenu après 15 minutes de centrifugation 2500 g ; le plasma citraté doit être utilisé dans les 24 heures ou conservé congelé, –20°C au moins, pendant mois maximum Juste avant utilisation, décongeler le plasma pendant 15 minutes dans un bain-marie 37°C Le plasma décongelé est stable pendant au moins 12 heures température du laboratoire L'utilisation de plasma provenant de sang prélevé sur Na EDTA est possible Les conditions de conservation sont les mêmes que celles préconisées pour le plasma citraté L'utilisation de sérum est possible pour la recherche des auto-anticorps anti-E 2GPI Il est toutefois préférable d'effectuer les dosages sur plasma Dans leur emballage d'origine, avant toute utilisation et conservés 2-8°C, les réactifs sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret Note : se référer aux recommandations du GEHT ou du CLSI/NCCLS pour toute instruction complémentaire sur la collecte, le traitement et le stockage des échantillons Rejeter tout prélèvement suspect Barrette Micro ELISA (COAT) : Ouvrir le sachet aluminium et sortir la barrette de puits nécessaire pour les dosages effectuer La barrette sortie du sachet aluminium doit être utilisée dans les 30 minutes Ouvrir autant de poches que de barette nécessaires pour la série de dosage Plasma ou échantillon tester ou contrôle : Anti FVIII Sample Diluent (SD) : Le réactif est prêt l'emploi Après ouverture, il peut être conservé 2-8°C, pendant semaines, en prenant soin d'éviter toute contamination lors de l'utilisation Contient de l’azide de sodium Le contrôle positif et le contrôle négatif sont prêts l'emploi et correspondent des plasmas déjà dilués au 1/100 x x Pipettes canaux permettant de distribuer des volumes de 50 300 μl Pipettes volume variable de 20 μl, de 20 200 μl et de 200 1000 μl x Matériel de lavage pour microplaques et agitateur x Lecteur de microplaques ELISA réglé une longueur d'ondes de 450 nm x Eau distillée Le plasma ou le sérum tester sont analysés dilués au 1/100 dans le diluant échantillon (SD) En présence d'échantillons avec un taux très élevé d'anticorps anti-VIII, diluer au 1/200 ou au 1/400 ou au-delà Les résultats obtenus devront alors être ajustés en fonction du facteur de dissolution D750-01/ZY/039A Réalisation du dosage : Sortir la quantité nécessaire de barrettes de puits des sachets aluminium et les placer dans le cadre fourni Introduire les réactifs dans les puits des micro-barrettes ELISA et réaliser le dosage comme indiqué dans le tableau ci-après : Réactif Volume Diluions du contrôle positif Anti-VIII IgG ou contrôle négatif 200 μl ou échantillons dilués au 1:100 ou Diluant échantillon (blanc) Procédure Introduire les dilutions: Contrôle positif ou contrôle négatif ou Echantillons dilués ou Diluant échantillon dans les puits de la plaque Incuber 60 minutes température du laboratoire (18-25°C) (a) (b) Solution de lavage (diluée 20x en eau distillée avant utilisation) Immunoconjugué anti-IgG (Fc J)HRP, reconstitué par ml de diluant pour immunoconjugué 300 μl Effectuer une série de lavages (a) 200 μl Immédiatement après le lavage, Introduire l'immunoconjugué dans les puits Incuber 60 minutes température du laboratoire (18-25°C) (a) Solution de lavage (diluée 20x en eau distillée avant utilisation) 300 μl Effectuer une série de lavages (a) Immédiatement, introduire cette solution dans les puits Nota : la répartition du substrat, barrette par barrette, doit se faire très précisément (c) Laisser la coloration se développer pendant minutes température du laboratoire (b) Arrêter la réaction en introduisant 0.45M d’acide sulfurique Respecter le même temps Acide sulfurique 0.45 M 50 μl de répartition, barrette par barrette, que celui utilisé pour le substrat ( c ) Attendre 10 minutes pour laisser stabiliser la coloration puis lire la DO obtenue 450 nm Soustraire les blancs (d) Substrat TMB/H2O2 200 μl Méthode quantitative : Positif ≥ 24 AU/ml b c d Eviter de laisser la plaque en pleine lumière lors des incubations et plus particulièrement lors du développement de la coloration L’utilisation d’un agitateur pour microplaque ELISA est possible Ne jamais laisser les puits de la plaque ELISA vides entre l'addition des réactifs ou après les étapes de lavage afin de préserver les protéines insolubilisées Le réactif suivant doit être ajouté dans les trois minutes afin d'éviter l'assèchement de la plaque Si nécessaire, garder les puits remplis de solution de lavage et les vider juste avant distribution du réactif suivant Régler le laveur de manière effectuer un lavage doux Une vidange trop violente des puits, lors de l’aspiration, peut endommager le coating et réduire la réactivité Lors de la distribution du substrat TMB, l'intervalle de temps entre chaque rangée doit être défini et respecté avec précision Il doit être le même lors de l'arrêt de la réaction par l'acide sulfurique Pour une lecture bichromatique, la longueur d’onde de référence utilisée peut être 620 nm ou 690 nm METHODE QUANTITATIVE: Les anticorps Anti VIII IgG peuvent être quantifiés en utilisant le contrôle positif en tant que calibrateur Le titre du calibrateur est indiqué pour chaque lot sur le papillon fourni dans le coffret La gamme d’étalonnage est réalisée directement dans les puits en rythme avec 100μL de contrôle positif et 100μL de Sample Diluent de C C/16 On dépose alors 100μL d’échantillon au 1/100 par puits Pour la dilution C/16, retirer 100μl de la solution après homogénéisation La méthode est ensuite identique celle de la méthode qualitative Courbe de calibration : Sur du papier millimétré, porter en abscisses le taux d’anticorps anti-VIII (concentration en AU/ml) et en ordonnées les DO 450 correspondantes, pour obtenir la courbe d’étalonnage de type ″ best fit ″ Pour la mesure des taux d’anticorps anti-VIII, seule la courbe d'étalonnage effective réalisée pour la série de dosages doit être utilisée Sur la courbe obtenue, déduire directement la concentration d’anticorps anti-VIII dans l’échantillon testé la dilution standard du test Pour obtenir la concentration en anticorps anti-VIII d’un échantillon testé plus dilué, multiplier le taux obtenu par D/50 (ex : x2 pour un échantillon testé la dilution 1/100, où D=100) Les logiciels spécifiques pour test ELISA (DYNEX, BIOLISE, etc ) peuvent être utilisés pour établir la courbe d’étalonnage et déterminer directement la concentration d’anticorps anti-VIII partir de la courbe d'étalonnage VALIDATION : Le contrôle positif et le contrôle négatif fournis dans le coffret, permettent de valider la bonne réalisation du dosage Les DO attendues pour le contrôle positif et le contrôle négatif peuvent varier de lot lot mais, lorsque le dosage est réalisé température du laboratoire, entre 18 et 25°C, ces DO sont toujours de : P = DO450 pour C+ 1/1 : t 1.0 N = DO450 pour Contrôle Négatif : d 0.15 ou ≤12 AU/ml LIMITES DE LA METHODE : Un lavage insuffisant de la plaque peut se traduire par un "bruit de fond" élevé et une valeur trop forte du contrôle négatif Vérifier que le lavage est efficace et correctement effectué Comme pour toute recherche d'auto-anticorps, la présence d'états inflammatoires ou infectieux, d'immun-complexes circulants, de gammapathies, de pathologies auto-immunes, peut entrner une réactivité aspécifique faible dans la zone douteuse ou faiblement positive APPLICATIONS / VARIATIONS PATHOLOGIQUES : L'hémophilie A est classiquement la conséquence d’un déficit congénital en facteur VIII, toutefois, une forme acquise due la présence d’inhibiteurs du facteur VIII (FVIII) peut survenir plus tardivement au cours de la vie Les patients développant des inhibiteurs du facteur VIII peuvent avoir des épisodes de saignement catastrophiques, malgré l'absence d'antécédents d'un trouble de la coagulation Bien que la maladie soit rare, elle peut entrner une morbidité et une mortalité importantes Ces inhibiteurs sont des anticorps qui neutralisent le FVIII et peuvent être soit des alloanticorps dirigés contre un Facteur VIII exogène ou des auto-anticorps Les inhibiteurs du facteur VIII d’origine exogène sont des alloanticorps d’isotype IgG qui apparaissent en cours de traitement chez 25 50% des patients atteints d'hémophilie A sévère L'hydrolyse du Facteur VIII par les anticorps anti facteur VIII a été présentée comme un mécanisme d'inactivation du Facteur VIII Les inhibiteurs du Facteur VIII peuvent également survenir chez des patients non hémophiles, bien que plus rarement, dans le cadre de Conditions idiopathiques – exemple : sujets sains âgés Maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde, etc Tumeurs malignes telles que les syndromes lymphoprolifératifs, les lymphomes et les tumeurs solides Réactions médicamenteuses la pénicilline, le chloramphénicol, la phénytoïne, etc Grossesse et post-partum Les facteurs de risque pouvant entrner le développement d'anticorps sont : La gravité de l'hémophilie: Les patients atteints d'hémophilie sévère sont beaucoup plus risque parce qu'ils sont exposés un traitement plus important en FVIII L'âge du patient et le degré d'exposition au FVIII: 15 -20% des enfants hémophiles traités fréquemment développent des anticorps dès l'âge de 20 ans Les patients présentant des anomalies génétiques qui se traduisent par l'absence de synthèse du facteur VIII sont plus risque de développer des anticorps après un traitement base de concentrés de FVIII Caractéristiques des anticorps anti Facteur VIII : La majorité des inhibiteurs du FVIII sont des anticorps IgG, plus précisément de la sous-classe IgG4 Il existe deux principaux types d'anticorps Type I anticorps - vu chez les hémophiles classiques L’inhibition du FVIII suit une cinétique linéaire Type II anticorps - ce sont les auto-anticorps, ils présentent un modèle plus complexe d'inhibition Les anticorps sont identifiés par leur capacité neutraliser le FVIII 37°C après une incubation de 2-3 heures SPECIFICITE ET CARACTERISTIQUES DU TEST: Le coffret ZYMUTEST anti-VIII, IgG, mesure spécifiquement la présence d'auto et d’allo-anticorps antiVIII de type IgG, qu’ils soient neutralisant ou pas Les isotypes IgM ou IgA n'étant pas dosés Les difficultés identifier la coexistence d'anticorps neutralisants anti-VIII (anti-VIII) et anticoagulant lupique (LA) sont principalement dues l'interférence de LA sur des tests anti-VIII Nous avons développé un test immuno-enzymatique (ELISA) qui utilise, pour la capture des anticorps, un Facteur VIII recombinant exempt de phospholipides Le but étant de révéler la présence d'anticorps anti-VIII en utilisant un système qui n'est pas affecté par le LA Le test permet la mise en évidence des anticorps anti VIII neutralisants et non neutralisants; pour différencier les deux sortes d’anticorps, l’effet neutralisant des anticorps doit être confirmé par des tests fonctionnels CARACTERISTIQUES DE LA METHODE QUANTITATIVE: Zone de mesure : 300 AU/ml Limite de détection : ≤ AU/ml Variabilité intra-essai: CV ≤ 10% Variabilité inter-essai: CV ≤ 10% REFERENCES : Les valeurs obtenues pour P et N, 20r1°C, sont indiquées pour chaque lot de réactif dans le papillon inclus dans le coffret Les DO450 obtenues peuvent varier en fonction de la température réelle laquelle est effectuée le dosage EXPRESSION DES RESULTATS : Les résultats sont exprimés l'aide des DO 450 obtenues, en positifs ou négatifs Pour des dilutions plus importantes, prendre en compte le facteur de dilution complémentaire appliqué INTERPRETATION DES RESULTATS : Méthode qualitative : Lorsque la réaction est réalisée 20r1°C, les résultats suivants sont obtenus : Positif : DO > 0.30 DO : 0.15 < zone grise < 0.30 Négatif : DO ≤ 0.15 Négatif ≤ 12 AU/ml Nota: Lorsque la température ambiante n’est pas comprise dans l’intervalle de température recommandé, les valeurs d’absorbances obtenues peuvent être affectées Le contrôle positif peut alors être utilisé pour ajuster la valeur seuil Le papillon fourni dans le coffret indique la DO 450 obtenue pour le contrôle positif du lot ZYMUTEST Anti-VIII IgG utilisé, et la valeur en % de cette DO450 correspondant la valeur seuil La valeur seuil ajustée est alors le pourcentage correspondant de la valeur de DO450 mesurée pour le contrôle positif dans la série réalisée Nota : a 12 AU/ml< zone grise < 24 AU/ml Alice D Ma and Daniel Carrizoza: Acquired Factor VIII inhibitors: Pathophysiology and treatment The American Society of Haematology 2006 Sallah S, Aledort L Treatment of patients with acquired inhibitors J Thromb Haemost 2005;3:595–597 Lavigne-Lissalde G, Schved JF, Granier C, Villard S Anti-factor VIII antibodies: a 2005 update Thromb Haemost 2005;94:760–769 Sebastien Lacroix-Desmazes, Jagadeesh Bayry; Namita Misra; Mickael P; and all: The prevalence of Proteolytic antibodies against factor VIII in Haemophilia A: new England of Medicine; vol 346, N°9, February 28, 2002 D.Söhngen, C Specker, and all: Acquired inhibitors to factor VIII in non-hemophilic patients Annals of Hematology, volume 74, Number 2/February 1997 Cohen AJ, Kessler CM Acquired inhibitors Baillieres Clin Haematol 1996; 9:331–354 D750-01/ZY/039A ... 1996; 9:331–354 D750-02/ZY/039A ZYMUTEST Anti VIII IgG MonoStrip IgG - Isotype (# ARK039A) Dosage ELISA de l’anticorps Anti Facteur VIII (FVIII), IgG isotype A usage de recherche in vitro exclusivement... mortality Antibodies can neutralize FVIII (but not all of them) and can either be alloantibodies against exogenous FVIII or autoantibodies Factor VIII inhibitors are IgG alloantibodies that... identifier la coexistence d'anticorps neutralisants anti- VIII (anti- VIII) et anticoagulant lupique (LA) sont principalement dues l'interférence de LA sur des tests anti- VIII Nous avons développé