Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids trong thực phẩm chức năng từ thảo dược

Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids trong thực phẩm chức năng từ thảo dược Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids trong thực phẩm chức năng từ thảo dược luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG Ngành Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh TS Trần Cao Sơn Viện: Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG Ngành Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng dẫn: Viện: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh Chữ ký GVHD TS Trần Cao Sơn Chữ ký GVHD Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Xuân Trường Đề tài luận văn: Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số SV: CB170131 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 30/6/2020 với nội dung sau: - Bổ sung Danh mục chữ viết tắt; - Bổ sung kết khảo sát thông số nguồn ESI(+) mục kết luận; - Sửa lỗi tả Giáo viên hướng dẫn Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Trường CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Mẫu 1c LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn dẫn PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh TS Trần Cao Sơn, xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh - môn Quản lý chất lượng Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Trần Cao Sơn – Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn thực đề tài Ban Lãnh đạo Cục An toàn thực phẩm Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ để hoàn thành nhiệm vụ nâng cao kiên thức q trình đào tạo Các thầy, Viện Cơng nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Trường Tất anh chị em đồng nghiệp phòng Quản lý tiêu chuẩn kiểm nghiệm, Cục An toàn thực phầm động viên, chia với khó khăn cơng việc thời gian tơi tham gia học tập nghiên cứu Các anh chị kỹ thuật viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hỗ trợ, giúp đỡ q trình thực phịng thử nghiệm Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm cổ động cho trình học tập thực luận văn Trân trọng cảm ơn! Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Trường MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Pyrrolizidine alkaloids 1.1.1 Khái quát Pyrrolizidine alkaloids 1.1.2 Nguồn thực vật chứa độc tố Pyrrolizidine alkaloids 1.1.3 Độc tính PAs 1.1.4 Quy định hành PAs 1.2 Phương pháp xác định độc tố PAs 1.2.1 Phương pháp chiết 1.2.2 Phương pháp làm 10 1.2.3 Phương pháp xác định 11 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 14 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 14 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 15 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Khảo sát điều kiện xác định độc tố PAs LC-MS/MS 16 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 16 2.3.3 Thẩm định phương pháp 17 2.3.4 Đánh giá hàm lượng độc tố PAs số đối tượng TPBVSK có nguồn gốc thảo dược thị trường 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 17 i 2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 18 2.4.3 Phương pháp thẩm định 18 2.4.4 Phương pháp lấy mẫu 19 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 20 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số PAs TPBVSK 21 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 21 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 26 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng 32 3.2 Thẩm định phương pháp 33 3.2.1 Độ đặc hiệu 33 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 34 3.2.3 Khoảng tuyến tính 36 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 38 3.2.5 Độ lặp lại khác ngày 40 3.3 Ứng dụng phương pháp để phân tích số sản phẩm TPBVSK có nguồn gốc thảo dược thị trường 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile PAs Pyrrolizidine alkaloids TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam SPE Cột chiết pha rắn LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loài thực vật chứa PAs gây độc người động vật Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng cột SPE SCX 11 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu xác định PAs LC-MS/MS 13 Bảng 2.1.Các độc tố PAs sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn trung gian 16 Bảng 2.3 Pha dung dịch chuẩn làm việc PAs 16 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích PAs 21 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS để phân tích PAs 22 Bảng 3.3 Điều kiện gradient 24 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mẫu 32 Bảng 3.5 Tỷ lệ ion PAs 33 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi Echimidine 38 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi Intermidine 39 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi Jacobine 39 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ thu hồi Senecionine 39 Bảng 3.10 Độ lặp lại khác ngày 40 Bảng 3.11 Kết phân tích mẫu thực tế 41 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc PAs dạng khác Hình 1.2 Các nhóm PAs phân loại theo base necine Hình 1.3 Cấu trúc số acid necic điển hình Hình 1.4 Một số PAs phổ biến Hình 3.1 Sắc đồ Ichimidine Jacobine sử dụng cột C18 cột TSK Gel 23 Hình 3.2 Sắc đồ tổng PAs 24 Hình 3.3 Sắc đồ MRM PAs 25 Hình 3.4 Biểu đồ kết khảo sát dung môi chiết 27 Hình 3.5 Biểu đồ kết khảo sát nhiệt độ 28 Hình 3.6 Biểu đồ kết khảo sát nồng độ acid 29 Hình 3.7 Biểu đồ kết khảo sát cột SPE 30 Hình 3.10 Đường chuẩn dung môi mẫu thực 32 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn PAs 34 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ 0,3 µg/kg 35 Hình 3.13 Đường chuẩn phân tích Echimidine 36 Hình 3.14 Đường chuẩn phân tích Intermedine 37 Hình 3.15 Đường chuẩn phân tích Jacobine 37 Hình 3.16 Đường chuẩn phân tích Senecionine 38 v Phụ lục 2-2 Khảo sát nhiệt độ Echimidine Intermidine 53 Jacobine Senecionine 54 Phụ lục 2-3 Khảo sát nồng độ acid Echimidine Intermidine 55 Jacobine Senecionine 56 Phụ lục 2-4 Khảo sát cột SPE Echimidine Intermidine 57 Jacobine Senecionine 58 Phụ lục Kết xác định độ lặp lại PAs sắc ký đồ Echimidine 59 Intermidine Jacobine 60 Senecionine 61 62 Phụ lục Sắc đồ phân tích mẫu thực Echimidine Intermidine 63 Jacobine Senecionine 64 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược Tác giả luận văn: Nguyễn Xuân Trường Khóa: 2017B Người hướng dẫn: PGS.TS Cung Thị Tố Quỳnh – Viện CN Sinh học & CN Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Trần Cao Sơn – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia Từ khóa (Keyword): Độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids, Thực phẩm chức từ thảo dược Nội dung tóm tắt: a) Lý chọn đề tài Hiện nay, xu hướng việc sử dụng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) từ nguồn gốc thảo dược, chủ yếu xuất phát từ thuốc y học cổ truyền ngày phổ biến Một số độc tố tự nhiên ngày thu hút quan tâm nhà khoa học giới alkaloid nhân pyrrolizidine (Pyrrolizidine alkaloids - PAs) PAs nhóm hợp chất có độc tính, sinh số lồi thực vật xếp vào nhóm độc tố thực vật (phytotoxin) Con người bị ngộ độc sử dụng lồi thực vật có chứa độc tố PAs trà thảo dược loại thuốc truyền thống, tiêu thụ ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc bị nhiễm độc tố Ngày nay, 6.000 loài thực vật (chiếm khoảng 3% thực vật tồn giới) biết có khả sinh tổng hợp PAs, chủ yếu loài thực vật thuộc họ Mồ hôi (Boraginaceae), họ Cúc (Asteraceae) họ Đậu (Fabaceae) Trong đó, khoảng 600 loại PAs xác định mơ tả có khả gây nhiễm độc cấp tính mãn tính gan, độc tính gen nhiễm sắc thể, đơi có liên quan đến hình số khối u phát triển da, bàng quang, não, tủy sống, tụy đường tiêu hóa Giới hạn tối đa cho phép PAs thực phẩm thiết lập số nước giới Tuy nhiên Việt Nam ban hành TCVN 12053:2017 quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa giảm thiểu nhiễm pyrrolizidine alkaloid thực phẩm thức ăn chăn nuôi Hiện nay, chưa có phương pháp thức để kiểm nghiệm độc tố PAs thực phẩm thực phẩm nói chung thảo dược nói riêng 65 b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu  Mục đích nghiên cứu: Đề tài “Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dược” thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định đồng thời số độc tố PAs thảo dược kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs số loại TPBVSK có nguồn gốc thảo dược thị trường  Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu loại độc tố PAs: Senecionine, Echimidine, Intermedine, Jacobine Đối tượng mẫu lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp để ứng dụng phương pháp bao gồm số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược thị trường: chè túi lọc, dạng siro uống, dạng viên c) Phương pháp nghiên cứu Xây dựng phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dược phương pháp LC-MS/MS d) Kết luận kiến nghị  Kết luận Đã khảo sát lựa chọn điều kiện LC-MS/MS để phân tích đồng thời Pyrrolizidine Alkaloids gồm Echimidine, Senecionine, Jacobine, Intermidine: - Tách sắc ký khí sử dụng cột TSK Gel - Phân tích MS/MS sử dụng nguồn ESI (+), chọn ion dùng để định lượng xác nhận cho chất phân tích Đã khảo sát lựa chọn điều kiện chiết làm đồng thời PAs mẫu TPBVSK có nguồn gốc thảo dược: - Dung môi chiết: H2SO4 0,05M 70°C - Làm cột chiết pha rắn trao đổi cation SCX Đã thẩm định phương pháp xác định đồng thời PAs với kết quả: - Phương pháp có tính đặc hiệu đạt u cầu - Khoảng tuyến tính tốt khoảng nồng độ từ - 40 µg/kg - Giới hạn phát 0,3 µg/kg; giới hạn định lượng µg/kg 66 - Độ lặp lại phương pháp tốt với độ lệch chuẩn tương đối < 7,5% - Độ thu hồi đạt từ 88,7 đến 116,7% đáp ứng yêu cầu theo AOAC Đánh giá hàm lượng độc tố 90 mẫu TPBVSK cho thấy có 28,8% số mẫu nhiễm PAs; nhiều mẫu nhiễm đồng thời loại PAs gồm Senecionine, Jacobine, Intermidine Chỉ có mẫu nhiễm Echimidine Một số loại thảo dược nguồn PAs sản phẩm TPBVSK bao gồm khoản đơng hoa, vịi voi, liên mộc  Kiến nghị - Áp dụng phương pháp phòng thử nghiệm trang bị hệ thống LC-MS/MS - Mở rộng nghiên cứu nhiều loại PAs mẫu khác để có đánh giá chi tiết hơn hàm lượng PAs sản phẩm TPBVSK thảo dược Việt Nam - Nghiên cứu để ban hành mức quy định giới hạn độc tố PAs TPBVSK có nguồn gốc thảo dược HỌC VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Xuân Trường 67 ... phương pháp xác định đồng thời số Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược? ?? thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định đồng thời số độc tố PAs thảo. .. Trường Đề tài luận văn: Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số SV: CB170131 Tác giả,... VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids thực phẩm chức từ thảo dược NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG Ngành Công nghệ thực phẩm Giảng viên hướng